Aislamiento, caracterización y estudios de actividad de bacteriófagos líticos sobre <i>Enterococcus spp.</i> en modelos in vivo e in vitro

Abstract

Desde su primera descripción en 1988, los enterococos resistentes a vancomicina (EVR) se han tornado un grave problema para la salud pública. La colonización precede y predispone generalmente a infecciones como endocarditis o bacteriemia especialmente en pacientes añosos, inmunocomprometidos o posquirúrgicos. Los EVR pueden colonizar el intestino de estos pacientes y pueden persistir durante largos períodos, lo cual resulta en costos muy elevados para los centros hospitalarios teniendo en cuenta los gastos de aislamiento y cohortización del paciente. Hasta el momento no ha podido establecerse un método que permita la descolonización de EVR en seres humanos. En este marco proponemos como objetivo general la utilización de bacteriófagos líticos como herramientas para ese fin. En la primera fase el objetivo específico fue el aislamiento y caracterización de bacteriófagos líticos apropiados para la descolonización. Para el aislamiento de los mismos se utilizaron muestras clínicas filtradas y ensayadas sobre cepas de enterococos tanto resistentes como sensibles a la vancomicina. Con este procedimiento se aislaron cinco bacteriófagos líticos sobre distintas cepas del género Enterococcus spp., los cuales fueron denominados siguiendo normativas taxonómicas internacionales como ΦBE1, ΦBE2, ΦBE3, ΦBE4, y ΦBE5 respectivamente. El fago ΦBE2 presentó un mayor espectro de infectividad, ya que resultó producir lisis sobre todas las cepas de EVR ensayadas. Se realizó la puesta a punto de un protocolo para la extracción y caracterización del material genético de cada uno de los bacteriófagos aislados y se construyó en particular una biblioteca genómica del bacteriófago ΦBE2. El fago ΦBE2 fue escogido además para realizar los experimentos de descolonización in vitro e in vivo. Se pusieron a punto las condiciones y medios apropiados para el almacenamiento a largo plazo de las suspensiones de fagos. La combinación de la utilización del buffer SM con una temperatura de -20°C resultó ser la condición apropiada para este fin. Se logró demostrar la capacidad lítica de los bacteriófagos ensayados tanto in vitro como in vivo. Se pusieron a punto las diferentes variables para trabajar con el modelo in vitro como con el modelo animal. Se trabajó con los diferentes bacteriófagos aislados y se concluyó que los mismos eran capaces de lisar diferentes aislamientos clínicos de enterococos tanto sensibles como resistentes a vancomicina. Además, se tomaron microfotografías electrónicas de los bacteriófagos aislados para estudiar su morfología y clasificarlos taxonómicamente. Para ello se tuvieron en cuenta caractericticas morfológicas de la cabeza y cola, las dimensiones de los fagos como asi tambien la homología de acidos nucleicos realizando la comparación con secuencias almacenadas en bases de datos. La segunda fase tuvo como objetivo específico la evaluación de los fagos en un modelo animal. Los ensayos realizados en el modelo de descolonización con células Caco-2, demostraron que la actividad del bacteriófago ΦBE2 se mantenía aun cuando las bacterias estaban adheridas a las microvellosidades. Se ensayaron diferentes variables para intentar determinar las vías y concentraciones óptimas de administración de los bacteriófagos en modelo murino. Se concluyó que la vía óptima de administración de las suspensiones de bacteriófagos de concentración conocida era la vía oral no forzada mediante la dilución de estas suspensiones en agua de bebida. Se determinó además la forma de recuento de las colonias bacterianas y de los bacteriófagos, como así también el agrupamiento y duración de cada experimento. En diferentes ensayos se observó que en los grupos de ratones tratados con las suspensiones fágicas individuales o un cóctel de tres fagos los recuentos de enterococos disminuyeron con valores estadísticamente significativos comparando con los grupos controles. Sin embargo no se logró la completa descolonización.