Estrategias reproductivas de moluscos gasterópodos

Abstract

Pomacea canaliculata, gasterópodo dulceacuícola de origen sudamericano, es la especie más sobresaliente de la familia Ampullariidae. Ha sido introducida en el sudeste asiático e islas del Océano Pacífico donde se ha convertido en una seria plaga para la agricultura, principalmente en cultivos de arroz y taro. Su presencia en estas zonas, así como en América Central y América del Sur, representa también un riesgo sanitario para la población, ya que es un hospedador intermediario del nematode Angiostrongilus cantonensis, agente causal de la meningoencefalitis eosinofílica, enfermedad potencialmente fatal para el hombre. Su invasión también ha mostrado un impacto ecológico en los ecosistemas acuáticos invadidos. Conocer su reproducción, es de especial interés debido a lo anteriormente mencionado. Los huevos son depositados fuera del agua, característica compartida con las restantes especies del género, formando masas de huevos de una intensa coloración rosada. La especie presenta una alta fecundidad, siendo una hembra capaz de depositar un total de 1.300 a 11.000 huevos a lo largo de su vida en condiciones de laboratorio. En los ampuláridos, así como en la mayor parte de los gasterópodos, el vitelo es de escaso desarrollo y en su lugar, el material nutritivo necesario para el desarrollo embrionario, se ubica externamente al embrión y se denomina fluido perivitelino (FPV). El FPV, en las especies de ampuláridos estudiadas, ha mostrado tener además, propiedades de protección ante factores bióticos y abióticos. Estas actividades biológicas se encuentran asociadas a las principales perivitelinas (proteínas del FPV), que en el caso de P. canaliculata se denominan PcOvo y PcPV2. En un contexto evolutivo, considerando que los huevos prácticamente no presentan depredadores, algunas de las actividades biológicas de las perivitelinas, como las propiedades antinutritivas, antidigestivas y neurotóxicas han sido interpretadas como una adquisición clave asociada a la oviposición aérea como defensa contra la depredación de los embriones en desarrollo. El FPV es sintetizado por un órgano accesorio del sistema reproductor femenino, la glándula del albumen (GA), también de llamativa coloración, que contribuye significativamente a la biomasa corporal de las hembras. Se desconoce en P. canaliculata, y en los gasterópodos en general, si durante su síntesis las perivitelinas están sujetas a modificaciones estructurales significativas, como sufren los precursores de las proteínas del vitelo o vitelinas, presentes en otros invertebrados y funcionalmente análogas, o si en cambio las perivitelinas son almacenadas en la GA ya en su forma final, biológicamente activa. En P. canaliculata existen indicios que apoyan esta última hipótesis, ya que los depredadores de caracoles adultos descartan la GA cuando se alimentan de hembras. Conocer una explicación para este comportamiento, desde un ángulo bioquímico, resulta interesante en lo que respecta al mecanismo de síntesis de perivitelinas, y al mismo tiempo en relación a la ecología de los depredadores de adultos del género Pomacea siendo que el motivo de dicho comportamiento y sus consecuencias nutricionales no han sido evaluados hasta el presente. La presente tesis doctoral tiene como objetivos generales: (1) contribuir al conocimiento de la biología reproductiva de P. canaliculata y, (2) contribuir al entendimiento de la perivitelogénesis en la GA desde una perspectiva bioquímica, su vínculo con el alto rendimiento reproductivo de la especie y su relación con los hábitos alimenticios de los depredadores de especies del género Pomacea. En particular se pretende aportar la primera información en gasterópodos sobre la síntesis de perivitelinas en lo referido a la estructura de sus precursores determinando si PcOvo y PcPV2 almacenadas en la GA presentan diferencias estructurales y funcionales respecto a las formas finales en el huevo. Esta información representaría a su vez un abordaje molecular para ayudar a explicar las causas del comportamiento de descarte de la GA exhibida por los depredadores de adultos de P. canaliculata, siendo que el órgano resultaría nocivo para los mismos. Por otro lado, se aborda dicho comportamiento desde una perspectiva ecológico-nutricional determinando si el consumo de hembras de P. canaliculata representa una desventaja energética para los depredadores como consecuencia del descarte de la GA. Por último, se evalúa la respuesta de la GA frente a la actividad reproductiva de cópula y oviposición, y ante distintos niveles de esfuerzo reproductivo en lo que respecta a la acumulación de los principales componentes de secreción y la expresión de las principales perivitelinas. Para llevar a cabo este estudio se realizó un análisis comparativo de la estructura-función de las perivitelinas PcOvo y PcPV2 aisladas de huevo y de la GA. Se analizó su movilidad electroforética, tiempo de retención en columnas cromatográficas y estructura nativa secundaria, terciaria y cuaternaria mediante espectroscopía de absorción, fluorescencia, dicroísmo circular y dispersión de rayos X a bajo ángulo (propiedades estructurales). A su vez se evaluó la resistencia a la digestión, el grado de neurotoxicidad y capacidad inhibitoria de tripsina del órgano (propiedades funcionales). Los resultados evidenciaron que la GA almacena las perivitelinas en sus formas maduras, biológicamente activas y ya listas para ser incorporadas a los huevos, a diferencia de los demás invertebrados que sintetizan formas inactivas que requieren de un procesamiento proteolítico previo u otras modificaciones importantes en su estructura antes de ser incorporadas en el huevo. Esto probablemente represente una vía más eficiente para la conversión de alimento en huevos, haciendo posible un alto rendimiento reproductivo. Por otro lado, los estudios funcionales indicaron que la GA presenta propiedades antinutritivas, antidigestivas y neurotóxicas, lo que explicaría plausiblemente el comportamiento de descarte del órgano por parte de los depredadores de hembras adultas de la especie. A continuación se evaluaron las consecuencias nutricionales asociadas a dicho comportamiento. Se determinó la composición bioquímica y el contenido energético de los tejidos de machos y hembras de P. canaliculata y se estimó la variación de estos parámetros en función de la talla. Los resultados indicaron que el consumo de hembras sería desventajoso desde una perspectiva energética y nutricional. Determinamos que a una misma talla, y sin considerar la GA, una hembra y un macho presentan un contenido de biomasa comparable. Sin embargo, los tejidos consumibles de las hembras presentan un contenido significativamente menor de proteínas y aproximadamente un 19% menos de energía que un macho de tamaño equivalente. Estos resultados reflejan la gran contribución de la GA a la biomasa corporal de la hembra, y la energía destinada y movilizada hacia este órgano durante la reproducción. Por último, se estudió la dinámica de la GA en respuesta al esfuerzo reproductivo y a la actividad reproductiva de cópula y oviposición. Se observó una recuperación de los principales componentes de secreción invertidos en las puestas (proteínas, polisacáridos y calcio) tal que la biomasa total de huevos depositada prácticamente duplicó la biomasa inicial de la GA. Sin embargo, luego de un esfuerzo reproductivo alto, el órgano no recuperó su capacidad reproductiva inicial en relación a los niveles de proteínas solubles, PcOvo y PcPV2 en particular, y de polisacáridos, mientras que los niveles de calcio total se recuperaron completamente. Frente a un esfuerzo reproductivo alto se observó también una reducción en el número de huevos por puesta. Estos resultados indican que la GA tiene una capacidad diferencial para recuperar sus componentes de secreción, presentándose la biosíntesis como uno de los factores limitantes para el proceso de oviposición a largo plazo. En conjunto, los resultados de la presente tesis doctoral indican que la fisiología y bioquímica de la GA está fuertemente relacionada con la alta capacidad reproductiva de P. canaliculata, siendo el principal órgano especializado que permite la rápida movilización de cantidades significativas de nutrientes hacia la futura progenie, y de manera coordinada con la actividad reproductiva. Parte de estas características probablemente estén dadas por la capacidad de sintetizar partículas estructuralmente complejas y multifuncionales como las perivitelinas de manera directa, es decir sin modificaciones postraduccionales previas, en contraste con sus análogas, las vitelinas de otros invertebrados. Por último, la observación de que la biosíntesis de componentes del FPV sería un factor limitante para el proceso de oviposición a largo plazo, sugiere inmediatamente un blanco de utilidad para el control poblacional de esta especie invasora.

The South-American freshwater gastropod, Pomacea canaliculata, is the most conspicuous species of the Ampullariidae family. It has been introduced to South East Asia and Pacific Islands where it has become a serious pest in rice and taro crops. In these regions, as well as in Central and South America, it also represents a sanitary risk for the human population, as it is an intermediate host of Angiostrongilus cantonensis, a nematode that causes eosinophilic meningoencephalitis which is a potentially fatal disease. This species has also been responsible for ecological impacts on invaded wetlands. The knowledge on its reproduction is therefore of special interest. As all members of the genus, P. canaliculata lays their eggs out of the water in conspicuous bright pink-reddish masses. The species has a high fecundity, a female being able to lay a total of 1,300 - 11,000 eggs under laboratory conditions. As in most gastropods, the vitellus is reduced in ampularids, and the nutrients for development are located outside the embryo, as a perivitelline fluid (PVF). Besides its role in embryo nutrition, the PVF has shown antinutritive, antidigestive, and/or neurotoxic properties, in all the ampularid species so far studied. These biological activities are associated to the main perivitellins (proteins of the PVF), which in P. canaliculata are called PcOvo and PcPV2. On an evolutionary context, the biological activity of perivitellins has been considered as key acquisitions associated to aerial oviposition for its role in embryo defenses against predation, rendering the eggs with virtually no predators. The PVF is synthesized by the albumen gland (AG), a female accessory reproductive organ widespread in gastropods, which also has a bright color in Pomacea and makes a significant contribution to the female body biomass. In P. canaliculata, and in gastropods in general, it is still unknown whether during its synthesis, the perivitellins, which are functionally analogous to vitellins (proteins of vitellus), are subjected to significant structural modification, as the precursors of vitellins are, or whether they are stored in the AG in its final form. There is evidence in P. canaliculata supporting the latter hypothesis, as the snail predators discard the AG when they feed on female snails. Trying to find an explanation for this behavior from a biochemical perspective is interesting regarding both, the perivitellins synthesis mechanism and the feeding ecology of Pomacea predators. The reasons for the already mentioned behavior and its nutritional consequences have not been evaluated yet. This PhD thesis has the following general objectives: (1) to contribute to P. canaliculata reproductive biology knowledge, and (2) to contribute to the understanding of the perivitellogenesis in the AG from a biochemical point of view, its association with the species high fecundity and with the feeding habits of Pomacea predators. In particular, we expect to provide the first piece of information regarding perivitellin synthesis, structure and function of its precursors in gastropods, by determining whether PcOvo and PcPV2 stored within the AG have structural and functional differences compared to their respective egg final forms. At the same time this information would represent a molecular approach to help explain the behavior exhibited by Pomacea predators, as the AG could be noxious for them. Additionally, we address the predators’ behavior from a nutritional and ecological perspective by evaluating whether feeding on a female of P. canaliculata represents an energetic disadvantage for predators after discarding its AG. Finally, we evaluate the effect of reproductive activity of mating and oviposition, and the effect of reproductive effort on the stored levels of the main AG secretion components, and on the gene expression levels of the main perivitellins. To carry out this study, we began performing a comparative structure-function analysis of the perivitellins PcOvo and PcPV2 isolated from egg masses and from the AG. We compared these two sets of perivitellins regarding their structural properties: electrophoretical mobility retention time in chromatographic columns, native secondary, tertiary, and quaternary structure, as determined by a combination of spectroscopic methods, including absorbance, circular dichroism, fluorescence and SAXS. We also evaluated some of their functional properties such as digestion resistance, neurotoxicity, and the AG extracts ability to inhibit trypsin activity. Results showed that the AG stores structurally mature and biologically active perivitellins, in contrast to the other invertebrates which synthesize inactive precursors that require a subsequent proteolysis or other significant modifications before being incorporated to the eggs. This is probably a more efficient mechanism for food conversion into egg production, making it possible a high reproductive output. Additionally, functional studies showed that the AG has antinutritive, antidigestive, and neurotoxic properties, which provides the first explanation of the behavior exhibited by snail predators: when they feed on a female snail they discard the AG which, according to this Thesis results, would be noxious for them. Then, we evaluated the nutritional consequences of the discarding behavior of snail predators. We determined the biochemical composition and the energetic content of P. canaliculata male and female tissues, and we also estimated the variation of these parameters as a function of snail size. Results indicate that female consumption by snail predators would be disadvantageous from a nutritional and energetic point of view. At a same size, without considering the AG, a female and a male have a similar biomass content, though. Female edible tissues have significantly lower protein content, and around 19% less energy content than a male of equivalent size. These results reflect the large contribution of the AG to the female body biomass, and the energy females allocate to this organ for reproduction during the reproductive season. Finally, we studied the AG physiological response to reproductive effort and to reproductive activity (mating and oviposition). We observed a restoring of the main secretion components (proteins, polysaccharides, and calcium) in the AG, in such a way that total egg biomass deposited nearly doubled the initial AG biomass. However, after a high reproductive effort, the restoring in the organ was not enough to maintain the initial reproductive potentiality for soluble proteins, PcOvo and PcPV2, and polysaccharides, while total calcium levels were completely restored. Additionally, in association with a high reproductive effort, a reduction in the number of eggs per clutch was observed. These results indicate that the AG has a differential ability to restore its organic and inorganic components, being biosynthesis a possible limiting factor to keep up with a high reproductive output. In conclusion, the results of this PhD thesis indicate that the AG physiology and biochemistry is highly related to P. canaliculata remarkable fecundity. The AG seems to be the main specialized organ that enables a fast nutrient allocation to offspring, which is also coordinated with the reproductive activity. Part of these qualities could be related to its ability to synthesize in a direct way, multifunctional and structurally complex particles, as the main perivitellins are. This contrasts with vitellins synthesis of other invertebrates which require post-translational modifications. Finally, considering that the biosynthesis in the AG seems to be a limiting factor for the long-term oviposition, the factors affecting this process could be useful targets for future studies aiming at reducing fecundity which is of outmost importance considering the negative impact this species spread causes in non native areas.