Estudio de la producción de poligalacturonasas de Aspergillus sojae: producción, caracterización y aplicación en procesos de vinificación

Abstract

El presente trabajo de tesis tiene tres partes principales. En la primera parte se describen estudios de producción de PGasa por A. sojae en cultivos sumergidos aprovechando residuos agroindustriales, poniendo especial atención en el uso de cáscaras de soja. Luego de un estudio preliminar de producción con varios subproductos, se eligió emplear cáscaras de soja y se continuó con la búsqueda de componentes relevantes del medio de cultivo y optimización de los mismos para maximizar la actividad PGasa, empleando fundamentalmente diseño experimental multivariado y metodología de superficie de respuesta. De esta forma se mejoró la productividad volumétrica al doble mediante una variación en el pH inicial del cultivo en un rango muy pequeño de pH ácido que oscila en 2.60. El proceso optimizado se transfirió exitosamente a biorreactores de tanque agitado en términos de productividad volumétrica. A su vez, se obtuvo una actividad PGasa de 42 U/ml con un rendimiento de 1.39 U/g de cáscara de soja, un valor que se sitúa dentro de los más elevados reportados con este subproducto. El incremento de la concentración del medio de cultivo al doble en biorreactor no se tradujo en una duplicación de la productividad volumétrica, y la evolución del oxígeno disuelto a lo largo del proceso es coherente con una limitación del cultivo en oxígeno. En este medio de cultivo el microorganismo produjo también actividad xilanasa. La caracterización morfológica del cultivo reveló que A. sojae se desarrolló como micelio disperso a valores de pH inicial de 2.40 -2.80 mientras que, a la inversa, a pH 5.40 predominó la morfología de pellets. Por otro lado, se estudió la producción de actividad PGasa con cáscaras de naranja, pomazas de durazno y damasco, empleando una cepa de A. sojae superproductora. Se utilizaron diseños de superficie de respuesta de Doehlert para estudiar la producción de PGasa con estos tres residuos por separado, y finalmente el cultivo se transfirió a biorreactores de tanque agitado en los que se ensayaron diferentes perfiles de agitación y aireación con un medio de cultivo compuesto por una mezcla de cáscaras de naranja y pomaza de damasco. Controlando el oxígeno disuelto con el flujo de aire a un valor fijo de agitación (600 rpm), la tensión de oxígeno disuelto se mantuvo sobre el 25 % a lo largo del cultivo y se obtuvieron los mejores resultados, una producción de 380 U/ml, que representa una mejora en 1.5 veces respecto a los niveles obtenidos llevando a cabo la fermentación a flujo de aire y velocidad de agitación constantes (1 vvm y 600 rpm). En la segunda parte se describe la producción, purificación y posterior caracterización de una endo-poligalacturonasa producida por Aspergillus sojae en cultivos sumergidos, utilizando como fuente única de carbono y energía cáscara de naranja. A partir del seguimiento de la cinética de producción de A. sojae en un medio de cultivo compuesto por cáscara de naranja molida y (NH4)2SO4, se escogió cosechar el cultivo a las 168 horas desde iniciado, por ser el momento en el cual la actividad enzimática, determinada por dos métodos distintos, alcanzó valores máximos. Una vez obtenido un sobrenadante libre de biomasa y partículas provenientes del medio de cultivo, la purificación se realizó por medio de una serie de pasos cromatográficos de intercambio iónico y exclusión molecular. Según análisis electroforéticos, se obtuvo una fracción homogénea con un PM de 47 kDa y un pI de 4.2. A destacar, la enzima probó ser considerablemente estable frente a condiciones desde muy ácidas hasta neutras (pH 1.5-6.5) y presentó un valor de KM particularmente bajo, 0.134 mg/ml, lo que da cuenta de su elevada afinidad por su sustrato. En condiciones estáticas la PGasa resultó ser completamente estable hasta 45° C, y presentó una vida media de inactivación térmica de 2 horas a 50° C. Además de su actividad frente a ácido poligalacturónico (APG) y pectina, la enzima exhibió actividad solubilizadora de pectina, siendo su rango de actividad óptima sustrato-dependiente, si bien actúa mejor en un rango de pH concertado de 3.3-5.0. Los análisis por cromotografía en capa fina (CCF) revelaron que el tri-galacturonano es el principal producto final de hidrólisis de APG, indicando el carácter endo- de la PGasa. La enzima permaneció estable y su actividad inalterada frente a SO2, etanol y varios cationes ensayados excepto Hg2+, el cual inactivó la actividad por completo. Estas propiedades convierten a la endo-PGasa de A. sojae en un potencial candidato para ser utilizado en los procesos de extracción y clarificación de jugos de fruta, y durante la elaboración de vino en la etapa pre-fermentativa de desfangado de mosto. La tercera parte comienza con la descripción del proceso de obtención de un preparado pectolítico de A. sojae (PP-AS), desde el cultivo del microorganismo a partir de cáscaras de naranja hasta la obtención de una preparación sólida. PP-AS se caracterizó en términos de actividades enzimáticas relevantes para aplicación vinícola y luego se aplicó, por un lado, al mosto de uva blanca previo a la fermentación alcohólica para evaluar la promoción de la clarificación del mismo, y por otro lado, durante la maceración fermentativa en vinificaciones en tinto con el fin de estudiar su efecto en el desarrollo del color del vino y en su composición fenólica y aminoacídica. De todas las actividades enzimáticas cuantificadas bajo condiciones de vinificación (pH 3.50 y 20° C), la actividad PGasa fue previsiblemente la principal, y probó ser estable e inalterable frente al SO2. También se verificó la existencia de actividad XYLasa, aunque en cantidades menores, y es destacable la ausencia de actividad pectinesterasa, la cual contribuye en la producción indeseable de metanol. La adición de PP-AS al mosto de uva blanca promovió en un período de tiempo razonable una clarificación efectiva del mismo ya que a diferencia del mosto sin adición exógena de pectinasas, el cual clarificó pobremente, los niveles de turbidez alcanzados fueron los recomendados para asegurar una fermentación alcohólica adecuada sin que el producto final pierda características sensoriales. Finalizada la elaboración de vinos blancos, aquellos elaborados a partir de los mostos clarificados con PP-AS presentaron niveles significativamente mayores que los vinos control de ácido L-málico y significativamente menores de ácido L-láctico, hecho característico de la fermentación maloláctica e indicativo de un metabolismo activo de bacterias ácido lácticas. Este resultado es atribuible a un desfangado eficaz gracias a la adición de enzimas pectolíticas, ya que durante la clarificación la carga microbiana disminuye sensiblemente y los mostos desfangados son menos proclives de sufrir fermentaciones indeseadas. Respecto a las vinificaciones en tinto, las actividades enzimáticas de PP-AS promovieron una extracción comparativamente más rápida de materia colorante ya que se alcanzó la máxima intensidad de color antes que en los vinos control. Luego de seis meses de almacenamiento en bodega, los vinos elaborados con PP-AS presentaron concentraciones más elevadas de ácidos cumárico, cafeico y aspártico (p < 0.05), sugiriendo una extracción mejorada de los componentes contenidos en las células de la uva.