Aislamiento, purificación y caracterización preliminar de una proteasa de látex de frutos de Morrenia brachystephana Griseb. (Asclepiadaceae)

Abstract

El látex proveniente de frutos de Morrenia brachystephana Griseb. (Asclepiadaceae) recogido sobre buffer fosfatos 0.1 M (pH 6.9) conteniendo EDTA y cisteína 5 mM y centrifugado a 16.000 x g durante 30 minutos constituye un extracto crudo con actividad proteolítica destacada frente a caseína como sustrato, en presencia de cisteína 12 mM. La preparación enzimática fue fuerte e irreversiblemente inhibida por muy bajas concentraciones de iodoacetato de sodio (0,0l mM) y de cloruro mercúrico (1 mM) e inhibida en forma parcial y reversible por PMSF 10 mM, sugiriendo que la proteasa pertenece al tipo cisteínico. La actividad caseinolítica resulta máxima a pH alcalino (pH 8,0-10,0). El extracto crudo muestra una notable estabilidad térmica (80% de actividad residual luego de 2 h a 60ºC). Mediante precipitación acetónica fraccionada, seguida de cromatografía de intercambio catiónico (CM Sepharose CL-6B Fast Flow), se obtienen dos fracciones proteolíticamente activas. La fracción principal (II) tiene una masa molecular relativa de 22,l kDa (SDS-PAGE) y un punto isoeléctrico superior a 9,3 (IEF).

Latex obtained from fruits of Morrenia brachystepluna Griseb. (Asckpiaduceae), received on 0.1 M phospate buffer (pH 6.9) containing 5 mM EDTA and 5 mM cysteine and centrifuged at 16,000 x g for 30 min gives a crude extract that shows high proteolytic activity when assayed on casein in the presence of 12 mM cysteine. The enzyme preparation was strongly and irreversibly inhibited by very iow concentrations of sodium iodoacetate (0.01 mM) and mercuric chloride (1 mM), but not fully and reversibly inhibited by 10 mM PMSF, suggesting that the protease belongs to the cysteine type. Maximum activity was reached at alkaline pH (8.0-10.0). The crude extract shows a remarkable thermal stability (80% of residual activity after 2 h at 60 OC). Fractioned acetone precipitation followed by cation exchange chromatography (CM-Sepharose CL-6B Fast Flow) allows the separation of two proteolytically active fractions, the principal of which has a relative molecular mass of 22.1 kDa (SDSPAGE) and an isoelectric point higher than 93 (IEF).