Caracterización fenotípica y genotípica de cepas de Enterococcus spp. aisladas de líquidos obtenidos por punción provenientes de infecciones invasivas humanas

Abstract

Enterococcus spp. es flora habitual de la microbiota intestinal de humanos y animales, así como importantes patógenos nosocomiales. Desde principios del siglo XX, se conoce que causan infecciones en humanos. Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium son las especies más relevantes clínicamente, particularmente en infecciones invasivas humanas. Estas especies se consideran patógenas oportunistas, ya que las infecciones graves se han asociado principalmente a pacientes inmunocomprometidos. Las infecciones invasivas causadas por enterococos pueden tener un origen alóctono o endógeno. Además, los enterococos presentan resistencia intrínseca a varios antibióticos, como los β-lactámicos, trimetoprima-sulfametoxazol y los aminoglucósidos que podrían mejorar su selección en el tracto gastrointestinal humano. E. faecium y E. faecalis han adquirido resistencia a la mayoría de las familias de antibióticos utilizados en terapia humana, en las últimas tres décadas. Esto llevó a la selección de clones enterocócicos resistentes a múltiples fármacos, lo que complica enormemente el tratamiento antimicrobiano, particularmente en el caso de infecciones graves. La adquisición de resistencia a vancomicina, una de las opciones terapéuticas de primera línea para las infecciones por enterococos, es uno de los problemas más preocupantes para la salud humana. El primer enterococo vancomicina resistente (EVR) reportado en América Latina fue una cepa de E. faecium de Argentina en 1998. Posteriormente, se realizaron estudios epidemiológicos para detectar EVR en diferentes hospitales de Argentina. El linaje clonal más frecuente de E. faecium vancomicina resistente (EFMVR) que circula en los hospitales argentinos parece ser el ST17. Se han realizado varios estudios de vigilancia epidemiológica aplicando técnicas moleculares en nuestro país, sin embargo se limitan principalmente a cepas EVR. No hay documentación de los perfiles de resistencia a los antimicrobianos y de la estructura poblacional de E. faecalis y E. faecium aislados de infecciones invasivas humanas en el Hospital Público de Tandil, Argentina hasta la fecha. El objetivo general de este trabajo de tesis fue caracterizar fenotípicamente y genotípicamente Enterococcus spp. aislados de líquidos obtenidos por punción, de infecciones invasivas humanas, de pacientes ingresados en el Hospital Municipal Ramón Santamarina (HMRS) de Tandil. Además, el segundo objetivo general fue detectar la resistencia a los antimicrobianos y evaluar in vitro varias opciones terapéuticas en enterococos resistentes a múltiples fármacos (MDR). Las cepas de Enterococcus spp. se recuperaron de forma retro-prospectiva a través de un estudio transversal a partir de infecciones invasivas de pacientes hospitalizados en el HMRS entre 2010 y 2014. Todas las cepas fueron identificadas con métodos convencionales fenotípicos y confirmadas por MALDI TOF-MS. Cuarenta y cuatro fueron identificadas como E. faecalis (69,8 %) y 19 como E. faecium (30,2 %). La caracterización molecular y la relación clonal se determinaron mediante electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) y tipificación de secuencias multilocus (MLST). La susceptibilidad a 15 antimicrobianos ampicilina, penicilina, ampicilina/sulbactam, cloranfenicol, vancomicina, teicoplanina, estreptomicina (resistencia de alto nivel: RAN), gentamicina (RAN), ciprofloxacina, levofloxacina, quinupristin-dalfopristin, clindamicina, eritromicina, linezolid y tigeciclina fue determinada por el método de difusión de disco y por concentraciones inhibitorias mínimas (CIM). El genotipo de resistencia a glucopéptidos fue determinado por PCR. La actividad antimicrobiana se evaluó in vitro mediante estudios de cinética de muerte utilizando curvas de letalidad. Este trabajo de tesis contribuye a generar conocimiento para continuar avanzando en la temática de la resistencia antimicrobiana y su estrategia de control en Argentina en el contexto de “Una Salud’’. Además, reconoce que, la detección y el control epidemiológico de los enterococos MDR es necesario realizarlo tanto en reservorios humanos como no humanos, para evitar su diseminación e impacto en salud pública.

Enterococcus spp. are normal inhabitants of the gut microbiota of human and animals as well as important nosocomial pathogens and were first known to cause human infections in the early 1900s. Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium are the most clinically relevant species, particularly in human invasive infections (e. g. bloodstream and peritoneal infections, abscess, endocarditis, etc.). These species are considered opportunist pathogens as severe infections have been mostly associated with immunocompromised patients. Invasive infections caused by Enterococci can have either an indigenous or allochthonous origin. Furthermore, Enterococci are intrinsic resistance to several antibiotics, such as β-lactams, trimethoprim-sulfamethoxazole and aminoglycosides that might enhance their selection in the human gastrointestinal tract. E. faecium and E. faecalis have acquired resistance to the majority of antibiotics families used in human therapy, in the last three decades. This led to the selection of multidrug resistant enterococcal clones, greatly complicating antimicrobial treatment, particularly in the case of severe infections. Acquisition of vancomycin resistance, one of the first line therapeutic options for enterococcal infections, is one of the most worrisome problems in human health. The first vancomycin resistant Enterococcus (VRE) reported in Latin America was an E. faecium strain from Argentina in 1998. After that, epidemiological studies to detect VRE in different hospitals in Argentina have been performed. The most frequent clonal lineage of vancomycin-resistant E. faecium (VREfm) in Argentinean hospitals appears to be Sequence Type (ST) 17. Even though, several surveillance molecular epidemiology studies have been performed in our country, those associated with Enterococcus spp. are mostly limited to VRE strains. There is no documentation of antibiotic resistance profiles and population structure of E. faecalis and E. faecium isolated of human invasive infections in the Public Hospital from Tandil, Argentina. The objective of this thesis work was to characterize phenotypically and genotypically Enterococcus spp. isolated from fluids obtained by puncture, from human invasive infections, of patients admitted to the Hospital Municipal Ramón Santamarina of Tandil (HMRS). Additionally, the second general objective was to detect antimicrobial resistance and to evaluate in vitro several therapeutic options in multi-drug resistant (MDR) strains. All Enterococcus spp. strains were recovered retro-prospectively through a cross-sectional study from invasive infections of hospitalized patients in the HMRS between 2010 and 2014. All strains were identified with phenotypic conventional methods and confirmed by MALDI-TOF MS. Forty-four were identified as E. faecalis (69.8 %) and 19 as E. faecium (30.2 %). Molecular characterization and clonal relatedness were realized by Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) and Multilocus Sequence Typing (MLST). Susceptibility to 15 antibiotics ampicillin, penicillin, ampicillin/sulbactam, chloramphenicol, vancomycin, teicoplanin, streptomycin (high level resistance: HLR), gentamicin (high level resistance), ciprofloxacin, levofloxacin, quinupristin-dalfopristin, clindamycin, erythromycin, linezolid and tigecycline was determined by the disc diffusion method and minimal inhibitory concentrations (MICs). Glycopeptide resistance genotype was determined by PCR. Finally, the in vitro antimicrobial activity was was assessed by time-kill studies. This thesis work contributes to generate knowledge to continue advancing in the topic of antimicrobial resistance and its control strategy in Argentina in the "One health context". Also, recognizes that the detection and epidemiological control of the MDR enterococci strains is necessary in both human and non-human reservoirs, to avoid their dissemination and impact in Public Health.