Estudio del efecto del receptor de ghrelina (GHSR) sobre la densidad en membrana de canales de calcio operados por voltaje (CaV) y sobre las propiedades biofísicas del sub-tipo CaV3

Abstract

Los canales de calcio dependientes del voltaje (CaV) acoplan la despolarización de la membrana al influjo de calcio, desencadenando una diversidad de procesos celulares dependientes del calcio. Los CaV son, por lo tanto, críticos en la configuración de la actividad y función neuronal. Existen al menos diez genes que codifican para distintos subtipos de CaV, los cuales poseen características biofísicas particulares que les permiten cumplir fun-ciones muy diversas como el control de la excitabilidad neuronal (CaV3), la liberación de neurotransmisores (CaV2) y la transcripción (CaV1). Muchos neurotransmisores y fármacos que actúan a través de receptores acoplados a proteína G (GPCR) modulan la actividad neuronal al alterar la expresión, el tráfico o la función de los CaV. Los mecanismos depen-dientes de GPCR que regulan la densidad de los CaV en la superficie celular se observan en muchas neuronas pero están menos estudiados que otros efectos celulares de los GPCR. En el primer capítulo de esta tesis mostramos que la actividad constitutiva del re-ceptor de la hormona ghrelina (GHSR) puede inhibir el tráfico hacia la membrana plasmática de varios subtipos de CaV (CaV1.2, CaV1.3, CaV2.2, CaV3.2 y CaV3.3) en ausencia de ghre-lina utilizando como sistema experimental células HEK293T transfectadas en forma transitoria. Además mostramos que las corrientes CaV1 nativas en cultivos primarios de neuronas hipotalámicas son moduladas por la actividad constitutiva de GHSR. Esta forma basal de inhibición de los CaV depende de la presencia de la subunidad auxiliar CaVβ. Dicha proteína promueve que la subunidad principal CaVα1 sea exportada desde el retículo endo-plásmico hacia la superficie celular. De este modo, las acciones de GHSR en el tráfico de los CaV sugieren un nuevo papel para esta vía de señalización en áreas del cerebro que controlan la ingesta de alimentos, la recompensa, el aprendizaje y la memoria. Por otro lado, observamos que la aplicación aguda de ghrelina a células coexpresando GHSR y CaV3.3 inhibía la corriente macroscópica registrada, efecto que no se observaba al coex-presar el subtipo CaV3.2. Este hallazgo originó el segundo capítulo de esta tesis donde exploramos el efecto de ghrelina en los tres subtipos de CaV3 de expresión neuronal. Pudi-mos demostrar que ghrelina inhibe las corrientes T nativas en neuronas hipotalámicas y mediante la expresión heteróloga en células HEK293T determinamos que el subtipo Cav3.3 resultó ser el único sensible a dicha modulación. La modulación de CaV3.3 por ghrelina comprende una reducción en la conductancia máxima, un desplazamiento a voltajes hiper-polarizados de la curva corriente voltaje (curva I-V) y de la curva del estado estacionario de inactivación, y una aceleración de la cinética de activación e inactivación. Además nuestra predicción basada en modelado indica que la inhibición de CaV3.3 atenuaría la estimulación de los disparos de potenciales de acción originados por la inhibición de las corrientes de potasio por parte de ghrelina. En resumen, descubrimos un nuevo blanco de ghrelina en las neuronas: los CaV3.3. Este mecanismo implicaría una regulación negativa de la activación neuronal ejercida por la ghrelina. En conjunto nuestro trabajo contribuye al conocimiento de la amplia gama de acciones de GHSR, un receptor potencialmente útil para el desarrollo de fármacos para tratar desórdenes alimenticios.

Voltage-gated calcium (CaV) channels couple membrane depolarization to calcium influx, triggering a range of calcium-dependent cellular processes. CaV channels are there-fore critical in shaping neuronal activity and function. There are at least ten genes that code for different subtypes of CaV, which have particular biophysical characteristics that allow them to fulfill very diverse functions such as neuronal excitability control (CaV3), neurotrans-mitter release (CaV2) and transcription (CaV1). Furthermore, many neurotransmitters and drugs that act through G protein-coupled receptors (GPCRs), modulate neuronal activity by altering the expression, trafficking, or function of CaV channels. GPCR-dependent mecha-nisms that down regulate CaV channel surface expression levels are observed in many neurons but are, by comparison, less studied. In the first chapter of this thesis, by using transiently transfected HEK293T cells we discovered that growth hormone secretagogue receptor (GHSR), a GPCR, can inhibit the forward trafficking of several CaV subtypes (CaV1.2, CaV1.3, CaV2.2, CaV3.2 y CaV3.3) even in the absence of agonist. We also show that native CaV1 currents in hypothalamic neuronal primary cultures are modulated by GHSR constitutive activity. This constitutive form of GPCR-mediated CaV inhibition depends on the presence of a CaVβ subunit. CaVβ subunits enhances CaVα1 subunits traffic from the endo-plasmic reticulum to the plasma membrane. The actions of GHSR on CaV channels trafficking suggest a role for this signaling pathway in brain areas that control food intake, reward, learning and memory. On the other hand we observed that the acute application of ghrelin on cells coexpressing GHSR and CaV3.3 inhibits macroscopic current, which is not observed for CaV3.2 subtype. This observation originated the second chapter of this thesis where we explored the effect of ghrelin in the three CaV3 neuronal subtypes. We demon-strated that ghrelin inhibits native CaV3 currents in hypothalamic neurons and in a heterologous expression system we determined that Cav3.3 subtype is the only one sensi-tive to the mentioned modulation. The effect of ghrelin on CaV3.3 comprises a reduction in maximum conductance, a shift to hyperpolarized voltages of the I-V and steady-state inac-tivation curves, and an acceleration of the activation and inactivation kinetics. Our model-based prediction indicates that the inhibition of CaV3.3 would attenuate the stimulation of firing originated from the inhibition of potassium currents by ghrelin. In summary, we discov-ered a new target of ghrelin in neurons: the CaV3.3. This mechanism would imply a negative feed-forward regulation of the neuronal activation exerted by ghrelin. In summary our work expands the knowledge of the wide range of actions of GHSR, a potentially useful receptor for the development of drugs to treat eating disorders.