Caracterización morfofuncional de células madre de tejidos dentales en cultivo

Abstract

Los objetivos de este trabajo fueron: Caracterizar morfológica y funcionalmente células madre mesenquimales (CMM) de pulpa, evaluar distintos métodos de cultivo y establecer un método de irradiación con laser de las células cultivadas. Se utilizaron terceros molares obtenidos en el Hospital Universitario con consentimiento del paciente y aprobación de Comité de Bioética de la FOLP-UNLP. Extraídas las piezas, se trasladaron al Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología de la FOLPUNLP. Se ensayaron distintos métodos de obtención y aislamiento de células: 1. digestión enzimática 2. obtención de explantos. Las células fueron caracterizadas mediante el estudio de marcadores de superficie específicos de CM, como CD73, CD90, CD105 y CD146 por citometría de flujo (Citometer BD FAC SCalibur), se estudiaron morfológicamente las células mediante MET y microscopio invertido con contraste de fases (Leica mod.DM IL LED). Posteriormente se cultivaron 5x 10 4 células en cada placa de Petri de 35 mm de diámetro (día 0). Luego de 24 horas (día 1) las placas fueron divididas en 3 grupos: G1.8: se aplicó densidad energética de 1.79 J/cm2,G3.6: se aplicó densidad energética de 3.57 J/cm 2,GC: Sin irradiación. Se utilizó laser diodo de 940 nm, con potencia regulada a 1W a t:48 y 72 hs. Morfológicamente se evidenciaron mitocondrias, vesículas y gránulos de secreción. En cultivo se observaron colonias de células fusiformes y estrelladas, formando agregados. La caracterización fenotípica por citometría de flujo para marcadores CD73, CD90, CD105 y CD146 resulto positiva. El método de irradiación con laser pudo adaptarse a los procesos de cultivo utilizados en el laboratorio. Se ha puesto a punto un eficiente método de obtención de CMM dentales, y podemos concluir que el mejor método para obtención, aislamiento y expansión es el del explanto. La morfología celular es un buen indicador de la calidad y desarrollo del cultivo.

The objectives of this work were: Morphologically and functionally characterize pulp mesenchymal stem cells (CMM), evaluate different culture methods and establish a low frecuency laser irradiation methods for cultures. Third molars obtained at the University Hospital with the patient's consent and approval of the Bioethics Committee of the FOLP-UNLP was used. Once the pieces were removed, they were transferred to the Molecular Biology and Biotechnology Laboratory of the FOLP-UNLP. Different methods of obtaining and isolating cells were tested: 1. enzymatic digestion obtaining explants. The cells were characterized by studying specific surface markers of CM, such as CD73, CD90, CD105 and CD146 by flow cytometry (Citometer BD FAC SCalibur), the cells were morphologically studied by MET and inverted microscope with phase contrast (Leica mod.DM IL LED). Subsequently, 5 x 10 4 cells were cultured in each 35 mm diameter Petri dish (day 0). After 24 hours (day 1) the plates were divided into 3 groups: G1.8: 1.79 J / cm2 energy density was applied, G3.6: 3.57 J / cm 2 energy density was applied, GC: No irradiation. 940 nm diode laser was used, with regulated power at 1W at t: 48 and 72 hours. Morphologically, mitochondria, vesicles and secretion granules were evidenced. In culture, colonies of fusiform and star cells were observed, forming aggregates. The phenotypic characterization by flow cytometry for markers CD73, CD90, CD105 and CD146 was positive. The laser irradiation method was suitable to be used in the laboratory culture procedures. An efficient method of obtaining dental CMM has been developed, and we can conclude that the best method for obtaining, isolating and expanding is that of the explant. Cellular morphology is a good indicator of crop quality and development.