Hidrocarburos cuticulares de Triatominos: etapas iniciales de la biosíntesis; rol en la resistencia a insecticidas

Abstract

La subfamilia Triatominae (Heteroptera: Reduviidae) incluye aproximadamente 140 especies de insectos hematófagos, vectores de la Enfermedad de Chagas o Tripanosomiasis americana. Esta es causada por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi y afecta entre 6 y 7 millones de personas en el mundo, principalmente en América Latina. Las especies de la subfamilia Triatominae están agrupadas en complejos y subcomplejos en base a similitudes morfológicas y de distribución geográfica, entre otras características. Las distintas especies de triatominos son capaces de colonizar el hábitat doméstico, peridoméstico y silvestre y se clasifican de acuerdo con el grado de asociación con el ser humano en especies primarias y secundarias. Las especies primarias más importantes de América Latina son: Triatoma infestans, principal vector primario en Argentina y el Cono Sur de América Latina; Triatoma dimidiata distribuida en México, toda América Central y el norte y oeste de América del Sur; y Rhodnius prolixus localizado en varios países de América del Sur y América Central. Las especies del subcomplejo Sordida (Triatoma sordida, Triatoma guasayana, Triatoma patagonica y Triatoma garciabesi) están incluidas, junto con otras, dentro de las especies secundarias de mayor importancia en Argentina y países limítrofes. Este subcomplejo se encuentra ampliamente distribuido en Argentina, Bolivia, sur de Brasil, Paraguay y Uruguay. El uso de insecticidas piretroides para el control de la Enfermedad de Chagas ha reducido tanto el rango geográfico como la prevalencia de infestación con T. infestans, T. dimidiata y R. prolixus. Sin embargo, se han detectado poblaciones de T. infestans con niveles altos y muy altos de resistencia a piretroides especialmente en Argentina y Bolivia. La resistencia a insecticidas piretroides es un fenómeno multifactorial que comprende tres mecanismos principales: la insensibilidad del sitio de acción o resistencia knockdown, la actividad aumentada de enzimas detoxificantes o resistencia metabólica y la disminución de la penetración o factor cuticular de resistencia. El integumento es el tejido más externo de los insectos y está formado por la cutícula y la epidermis subyacente. Tiene una importancia fundamental en el crecimiento, el metabolismo y la fisiología general de los insectos. La cutícula comprende la epicutícula más externa y la procutícula. La epidermis incluye diversos tipos celulares como las células epidérmicas, los oenocitos, las glándulas dermales y las células tricógenas. Además de su activo rol en el metabolismo general del organismo, las células de la epidermis sintetizan todos los componentes de la cutícula y se ha demostrado que en particular los oenocitos están involucrados en la biosíntesis de los hidrocarburos y demás lípidos cuticulares. Los hidrocarburos cuticulares no sólo están implicados en evitar una pérdida de agua letal por evaporación, sino que participan en la comunicación química y también tienen un rol relevante en evitar la penetración de insecticidas. Estudios de nuestro laboratorio demostraron que la remoción de los hidrocarburos cuticulares incrementaba la penetración de insecticidas y más recientemente se mostró por primera vez en insectos, un incremento significativo de los hidrocarburos cuticulares en ejemplares de T. infestans resistentes a piretroides, asociado a una disminución de la penetración de deltametrina. Por otra parte, los hidrocarburos cuticulares han sido usados como marcadores taxonómicos para estudiar la variabilidad inter e intraespecífica en numerosas especies de insectos y en nuestro laboratorio se han usado para analizar la variabilidad intraespecífica de T. dimidiata y T. infestans, dos de los 3 principales vectores de la Enfermedad de Chagas. La FAS de insecto es una enzima que contiene siete dominios funcionales y que actúa como homodímero, catalizando la síntesis de ácidos grasos de cadena larga a partir de acetil-CoA y malonil- o metilmalonil-CoA. La síntesis de los hidrocarburos y otros lípidos cuticulares de insecto se inicia a partir de la acción de ácido graso sintasas (FASs) específicas del integumento. Los ácidos grasos de cadena larga participan en diversos procesos biológicos tales como la transducción de señales, constituyen las membranas celulares, actúan como reserva energética, etc. Los productos de las FASs del integumento son a su vez sustrato de elongasas de ácidos grasos (ELOVLs) específicas de sustrato que producen ácidos grasos de cadena muy larga. Los acil-CoA liberados del sistema elongante son sustrato de diversas enzimas como acil-CoA reductasas (FARs) y citocromos P450 de la familia 4G (CYP4Gs) para formar hidrocarburos, alcoholes grasos, ceras y demás lípidos cuticulares. En este trabajo de tesis, en primer lugar, se llevó a cabo la anotación de genes de la biosíntesis y metabolismo de lípidos cuticulares de T. infestans a partir de un transcriptoma de integumento disponible en el laboratorio y se midió mediante PCR cuantitativa en tiempo real (RT- qPCR) la expresión de genes codificantes de enzimas involucradas en la formación de hidrocarburos cuticulares (FAS, ELOVL, FAR, CYP4G) en ejemplares resistentes a piretroides comparada con respecto a ejemplares susceptibles. Se detectó una sobreexpresión en los insectos resistentes de varios genes codificantes de ELOVL y CYP4G, que podría contribuir a explicar el mayor contenido de hidrocarburos cuticulares observado en estos ejemplares. Asimismo, se detectó en los insectos resistentes una sobreexpresión de genes codificantes de esterasas y CYPs del clan 3, lo que junto con otros resultados de nuestro laboratorio (aumento del contenido de HC y penetración disminuida de insecticida) sugiere una participación activa del integumento en el mecanismo de resistencia metabólica. En segundo lugar, se caracterizaron molecularmente los tres genes codificantes de FAS identificados previamente en el genoma de R. prolixus (RPRC000123, RPRC000269 y RPRC002909), y dos genes en T. infestans (KY797274 y KY805857) obtenidos a partir del transcriptoma de integumento de este insecto. Los análisis mediante RT- qPCR mostraron que los transcriptos de los genes RPRC000123, RPRC002909 y KY805857 se expresan principalmente en el integumento, mientras que los de los genes RPRC000269 y KY797274 se expresan en el cuerpo graso. Los genes de FAS ya caracterizados en D. melanogaster, junto con el análisis filogenético y de expresión diferencial en distintos tejidos de los genes codificantes de FAS en estos triatominos sugieren que, el gen RPRC000269 de R. prolixus y el gen KY797274 de T. infestas son ortólogos del gen FASN1 (CG3523), el gen RPRC002909 de R. prolixus es ortólogo del gen FASN2 (CG3524), mientras que el gen RPRC000123 de R. prolixus y el gen KY805857 de T. infestans son ortólogos del gen FASN3 (CG17374). Usando como modelo experimental a R. prolixus, se silenciaron los tres genes de FAS mediante la técnica de interferencia de ARN. El silenciamiento de los genes RPRC000269 y RPRC002909 no afectó la viabilidad de los insectos mientras que los insectos con el gen RPRC000123 silenciado, criados en condiciones de humedad estándar (45%), murieron inmediatamente luego de la muda al siguiente estadio, sin esclerotizar y oscurecer la cutícula. El análisis de los ácidos grasos e hidrocarburos del integumento de estos últimos, efectuado mediante cromatografía gaseosa capilar acoplada a un detector de ionización de llama (CGC-FID) o de espectrometría de masas (CGC-MS) reveló una disminución significativa en el contenido de ácidos grasos lineales y ramificados y de HC ramificados. Los insectos con el gen RPRC000123 silenciado y expuestos a condiciones de alta humedad (96%) sobrevivieron durante las 48hs posteriores a la muda. De esta manera se pudo determinar que la FASN3 de R. prolixus es esencial para la formación de los precursores de los hidrocarburos que impermeabilizan la cutícula. En tercer lugar, se analizaron las relaciones filogenéticas entre T. infestans y las diversas especies del subcomplejo Sordida empleando los hidrocarburos cuticulares como caracteres taxonómicos para la construcción de cladogramas según el modelo de Neighbor-Joining. Se pudo determinar a las poblaciones de T. infestans, la mayoría de las poblaciones de T. guasayana y dos de T. garciabesi como grupos monofiléticos. No se pudieron establecer relaciones filogenéticas de la mayoría de las poblaciones de T. sordida dado por la presencia de politomías. Los resultados obtenidos en esta tesis aportan información relevante sobre el rol del integumento en la resistencia a insecticidas. Asimismo, permiten avanzar en el conocimiento de las funciones e importancia de las ácido graso sintasas de insecto, las cuales han sido escasamente estudiadas.

The Triatominae Subfamily (Heteroptera: Reduviidae) includes about 140 species of hematophagous insects, which are vectors of the Chagas disease or American tripanosomiasis. This illness, caused by the protozoan parasite Trypanosoma cruzi, affects 6 to 7 million people worldwide, mostly in Latin America. Triatomine species are grouped in non-taxonomic categories (complexes and subcomplexes) based on similarity in morphology and geographic distribution, among other features. Triatomine species are considered as primary species if they are able to form permanent colonies inside human dwellings, or secondary ones if they live mostly in the peridomestic and sylvatic habitats and occasionally invade human houses. The most important primary species in Latin America are: Triatoma infestans, distributed in the Southern Cone region of South America, Triatoma dimidiata, with a wide distribution form Mexico, throughout Central America to Northern South America, and Rhodnius prolixus, found in some countries of Central and South America. The species belonging to the Sordida subcomplex (Triatoma sordida, Triatoma guasayana, Triatoma patagonica and Triatoma garciabesi) are considered secondary vectors of the disease in our region. This subcomplex is distributed in Argentina, Bolivia, Southern Brazil and Uruguay. The use of pyrethroid insecticides has reduced vector populations and the prevalence of the disease. However, pyrethroid resistance has raised in several T. infestans populations from Argentina and Bolivia, reducing the efficacy of control programs. Insecticide resistance involves three major mechanisms: decreased sensitivity of the insecticide’s target site, increased metabolic detoxification of insecticides, and decreased cuticle penetration. The integument, formed by the cuticle and the underlying epidermis, is the outer insect tissue. It has a major relevance in development, general metabolism and physiology of insects. The cuticle is formed by the outer epicuticle and an inner procuticle. The epidermis includes different cell types such as the epidermal cells, oenocytes, dermal glands and trichogen cells. It is involved in the synthesis of all the cuticle components but also participate in general metabolism, for instance, exchanging lipids with the fat body. In particular, the oenocytes have been shown to be the site of synthesis of the hydrocarbons and other cuticle lipids. Cuticle hydrocarbons are involved not only in waterproofing the cuticle but also, they participate in chemical communication and more recently, evidence has been gathered on their contribution to diminish the penetration of insecticides and other chemicals through the cuticle. Early studies from our lab showed that solvent-removal of the cuticle lipids increases insecticide penetration and insect mortality in T. infestans. More recently, evidences were first provided in an insect, that higher cuticle hydrocarbon content is correlated with diminished deltamethrin penetration in pyrethroid-resistant T. infestans samples, compared to pyrethroid-susceptible insects. Due to their species-specificity, cuticle hydrocarbons have been used as taxonomic characters to study the inter- and intraspecific variability of several insect species. In triatomines, cuticle hydrocarbons were used to assess the intraspecific variability of T. dimidiata and T. infestans, as well as to differentiate between the genera Triatoma, Rhodnius and Pastrongylus. The insect FAS is a very large protein containing seven enzymatic domains, which catalyze the biosynthesis of long chain fatty acids using acetyl-CoA as primer and either malonyl-CoA or methylmalonyl-CoA as elongating unit. Integument fatty acid synthases (FASs) are involved in the synthesis of the long chain fatty acids, precursors to hydrocarbons and other cuticle lipids. FAS products are elongated to very long chain fatty acids (VLCFAs) by substrate-specific fatty acyl-CoA elongases (ELOVLs), which form carbon chains. VLCFAs are reduced by fatty acyl-CoA reductases (FARs) to form fatty alcohols (FA). FA can be later decarbonylated by cytochromes P450 4G (CYP4Gs) to form hydrocarbons. In this thesis, I have firstly annotated several genes involved in cuticle lipid biosynthesis and metabolism obtained from a T. infestans integument transcriptome. The relative expression of some genes involved in the cuticle hydrocarbon biosynthesic pathway (FAS, ELOVL, FAR, CYP4G) was measured by quantitative PCR (RT-qPCR) in pyrethroid-resistant samples of T. infestans, compared to pyrethroid-susceptible samples. Some ELOVL and CYP4G genes were overexpressed in the resistant samples, which might explain their higher cuticle hydrocarbon content. Additionally, some genes coding for carboxylesterases and CYP´s from the clan 3 were overexpressed in the resistant insects. Together with other results from our lab, present results support the participation of the integument in insecticide detoxification. Secondly, I have molecularly characterized the three FASN genes previously identified in the R. prolixus genome (RPRC000123, RPRC000269 and RPRC002909) and two genes annotated from the T. infestans integument transcriptome (KY797274 and KY805857). RT- qPCR analysis showed that RPRC000123, RPRC002909 and KY805857 genes are expressed in the integument while RPRC000269 and KY797274 are mostly expressed in the fat body. Based in the D. melanogaster FAS genes already characterized, the R. prolixus RPRC000269 and the T. infestans KY797274 are orthologues of the FASN1 (CG3523) gene, the R. prolixus RPRC002909 is orthologue of the FASN2 (CG3524) gene, while the R. prolixus RPRC000123 and the T. infestans KY805857 are orthologues of the FASN3 (CG17374) gene. The expression of R. prolixus RPRC000123, RPRC000269 and RPRC002909 genes was silenced by RNA interference. Under standard rearing conditions (45% RH), RPRC000269- and RPRC002909-silenced insects molted to the next stage and survived normally. In contrast, RPRC000123-silenced insects died immediately after molting, without concluding the sclerotization and darkening of the cuticle. Capillary gas chromatography analysis of integument fatty acids and hydrocarbons showed a significant reduction of both lipid classes in silenced insects, compared to controls. Placing the RPRC000123-silenced insects into a humid chamber (96% RH) 3 days prior to the expected molt, helped insects to survive for about 24 h after molting, with a complete sclerotization of their cuticles. These experiments showed that the R. prolixus FASN3 (RPRC000123) gene is essential in forming the long chain fatty acids, precursors to cuticle hydrocarbons and other lipids that waterproof the insect cuticle. Thirdly, cuticle hydrocarbons were used as taxonomic characters to analyze the phylogenetic relationship between the species of the Sordida subcomplex and T. infestans. The analysis showed a monophyletic status for all the T. infestans populations and most of the T. guasayana and T. garciabesi ones. However, the analysis failed in establishing the relationships between most of the T. sordida populations due to the presence of politomies. This thesis contributes to understand the roles of the integument in insecticide resistance. It helps to gain understanding into the function of insect fatty acid synthases, which have been poorly studied.