Caracterización funcional de factores de transcripción asociados a la respuesta a auxinas en raíces de M. truncatula

Abstract

Las plantas leguminosas tienen la capacidad de formar dos tipos de órganos postembrionarios en sus raíces; por un lado, las raíces laterales (RLs) que participan en la captura de agua y nutrientes, y por otro, los nódulos fijadores de nitrógeno que surgen como resultado de la asociación simbiótica con bacterias del suelo llamadas rizobios. Esta interacción simbiótica permite la asimilación de nitrógeno atmosférico al metabolismo de la planta. La formación de nódulos fijadores de nitrógeno depende de un intercambio de señales entre ambos simbiontes, en el cual una molécula de naturaleza lipo-quitooligosacárida secretada por los rizobios, denominada factor Nod, es responsable de la activación de dos programas morfogenéticos en la raíz de la planta: la organogénesis del nódulo y la infección microbiana. Ambos tipos de órganos influencian directamente el crecimiento y desarrollo de la planta, por lo que comprender los mecanismos del desarrollo de raíces laterales y nódulos es crucial para mejorar la productividad de los cultivos de plantas leguminosas en sistemas agrícolas. Las auxinas son hormonas vegetales con funciones cruciales en el desarrollo y la vida de las plantas. Diversos trabajos han demostrado que las raíces laterales y los nódulos comparten programas de desarrollo superpuestos que convergen en la formación e interpretación de los niveles máximos de auxina (auxina máxima). La percepción e interpretación de esta auxina máxima involucra una cascada de señalización que culmina en la activación de factores de transcripción de respuesta a auxinas (ARFs por Auxin Response Factors). Los ARFs constituyen una gran familia de factores que median diferentes programas de desarrollo regulados por auxinas en las plantas. En particular, los ARF2, ARF3 y ARF4 son regulados postranscripcionalmente por una vía que involucra al microRNA390 (miR390) y al transcripto no codificante TAS3 (Trans-Acting siRNA 3). El clivaje de TAS3 guiado por el miR390 da lugar a la producción de pequeños RNAs de interferencia que actúan en trans (tasiRNAs por transacting interference small RNA) produciendo el clivaje de los transcriptos ARF2, ARF3 y ARF4. Anteriormente, en nuestro laboratorio se demostró que la activación constitutiva de la vía miR390/TAS3 promueve el alargamiento de las raíces laterales, pero afecta negativamente la organogénesis de los nódulos y la infección por rizobios durante la simbiosis fijadora de nitrógeno establecida entre la leguminosa Medicago truncatula y su par simbiótico Sinorhizobium meliloti. En este trabajo de tesis doctoral, observamos que la regulación de MtARF2, MtARF3 y MtARF4a/b en respuesta a los rizobios depende de la percepción del factor Nod. A su vez, proporcionamos evidencia de que el silenciamiento simultáneo de MtARF2, MtARF3, MtARF4a y MtARF4b o una mutación en el gen MtARF4a restringen la formación de nódulos y reducen el inicio y la progresión de los eventos de infección. Evidenciamos también que el silenciamiento de MtARF2, MtARF3, MtARF4a y MtARF4b altera los niveles del RNA mensajero (mRNA) que codifica el factor de transcripción de tipo GRAS NSP2 (Nodulation Signaling 2), el cual es un componente de la vía de señalización temprana de la nodulación. Ensayos de inmunoprecipitación de cromatina seguida de PCR (ChIP-PCR) indicaron que MtNSP2 sería un target directo de MtARF2, sustentando la hipótesis que la vía miR390/TAS3/ARFs se interconecta directamente con la ruta de señalización del factor Nod. Además, las raíces con niveles reducidos de MtARF2, MtARF3, MtARF4a y MtARF4b, así como las plantas mutantes arf4a, exhiben una arquitectura de raíz alterada, evidenciada en una reducción en la longitud de las raíces (principal y lateral) y un aumento en la densidad de las raíces laterales. A partir de un análisis transcriptómico se identificó que el gen MtLBD17/29a -un miembro de la familia LBD (Lateral Organ Boundaries Domain)- aumenta su expresión en respuesta al rizobio en raíces control, pero no en raíces que poseen activada la vía miR390/TAS3. Tampoco se verificó un aumento de los niveles del transcripto MtLBD17/29a en respuesta al rizobio en raíces silenciadas en MtARF2, MtARF3, MtARF4a y MtARF4b o en mutantes en MtARF4a. Más aun, ensayos de ChIP-PCR indicaron que MtARF2 se une directamente a una región promotora del gen MtLBD17/29a, sugiriendo que MtLBD17/29a sería un target directo de MtARF2. Los estudios de expresión espacio temporal mediante fusiones del promotor de MtLBD17/29a a genes reporteros revelaron que el promotor es activo en la zona meristemática de las raíces principales y laterales y en los primordios de las raíces laterales. Además, se observó actividad del promotor MtLBD17/29a en las células de la raíz subyacentes al sitio de infección del rizobio en etapas tempranas de la interacción simbiótica, y en las células del nódulo que rodean a las células infectadas en etapas más tardías de la simbiosis. Dicha expresión se solapa con la expresión de genes que son miembros de la vía miR390/TAS3 y del gen MtARF4a. De manera similar a lo descripto para MtARF2, MtARF3 y MtARF4a/b, la regulación de MtLBD17/29a en respuesta a los rizobios es dependiente de la percepción del factor Nod y requiere del regulador transcripcional maestro de la nodulación NIN (Nodule INception). Tanto el silenciamiento como la sobrexpresión de MtLBD17/29a afectaron la formación de nódulos y redujeron el número de los eventos de infección, sugiriendo que se requiere una fina regulación de los niveles de MtLBD17/29a para el establecimiento exitoso de la simbiosis fijadora de nitrógeno. Observamos también que el silenciamiento de MtLBD17/29a altera los niveles de RNA mensajero del gen MtNSP2. Por otra parte, las plantas que sobreexpresan MtLBD17/29a o silenciadas en dicho gen exhibieron una arquitectura de raíz alterada: mientras que las plantas silenciadas mostraron una reducción en la longitud de las raíces (principal y lateral) y un incremento en la densidad de las raíces laterales, las plantas que sobrexpresan MtLBD17/29a exhibieron un fenotipo opuesto, un aumento en la longitud de las raíces y una disminución en la densidad de las raíces laterales. En conjunto, nuestros resultados sugieren que estos miembros de la familia ARF y LBD son factores de transcripción que actúan de manera jerárquica modulando los programas morfogenéticos de desarrollo de las raíces y la formación de nódulos fijadores de nitrógeno.