Aporte en el desarrollo de insecticidas biológicos basados en el entomopátogeno Leptolegnia chapmanii (Straminipila: Peronosporomycetes) para el control de mosquitos vectores

Abstract

El control biológico es una estrategia utilizada en la agricultura y en la gestión de plagas para reducir o eliminar poblaciones de organismos dañinos (perjudiciales a cultivos o vectores de enfermedades), utilizando microorganismos u otro agente biológico en lugar de agentes químicos. Los diferentes microorganismos utilizados en el control biológico pueden ser bacterias, hongos, virus, nematodos y protozoos. En este trabajo de investigación se utilizó Leptolegnia chapmanii, un pseudo-hongo entomopatógeno de diferentes especies de mosquitos, dentro de las cuales encontramos Aedes aegypti, un vector de enfermedades de interés sanitario. La capacidad de este microorganismo de afectar específicamente a larvas de mosquitos y no perjudicar a otros organismos “no blanco”, generó interés en profundizar su estudio como agente de control biológico, planteando el objetivo de desarrollar una metodología para la producción y almacenamientos de productos basados en L. chapmanii. En primera instancia se analizó la formación de pellets y la cinética de crecimiento de L. chapmanii a escala de laboratorio, utilizando tres medios de cultivo (Peptona-Extracto de levadura-Glucosa (PYG), Semilla de Girasol (SG) y Harina de Soja (HS)) bajo tres condiciones de agitación diferentes (en agitador orbital a 150 rpm, en agitación y frascos Erlenmeyer con baffles y sin agitación). Los pellets obtenidos en estos ensayos tuvieron diferentes zonas, independientemente del tipo de medio de cultivo y la agitación. Se hallaron tres zonas: un núcleo, el cual permitió el crecimiento radial, una zona donde se genera autólisis para el mantenimiento, y la tercera zona denominada pilosa, donde las hifas están viables. El tipo de agitación influyó en las características de los pellets y en su cantidad. Los dos sistemas con agitación permitieron una cantidad mayor de pellets con rango de diámetros variables, creciendo en el seno del líquido y siendo más compactos; en cambio, el sistema sin agitación solo formó un pellet en la interfase aire-agua siendo más flexibles. Además, se realizó la cinética de crecimiento para los tres medios de cultivo en las tres condiciones de agitación. Para el medio PYG se obtuvieron los siguientes resultados: con agitación fue 40±7 g/L de peso húmedo y de 1.6±0.2 g/L de peso seco (5 días), para el sistema con bafles fueron de 51±28 g/L de peso húmedo y de 2±1 g/L de peso seco (5 días) y para el sistema sin agitación el peso húmedo fue de 45±8 g/L y el peso seco fue de 1.2±0.2 g/L (12 días). Para el medio SG en las dos condiciones de agitación la biomasa máxima se detectó en el quinto día, en cambio, sin agitación ocurrió en el séptimo día; para el sistema con agitación se obtuvo 67±27 g/L de peso húmedo y 6±2 g/L de peso seco, para el sistema con bafles se obtuvo 81±7 g/L de peso húmedo y 5±1 g/L de peso seco y para el sistema sin agitación se obtuvo 33±6 g/L de peso húmedo y 4±1 g/L de peso seco. Para el medio HS, los dos sistemas con agitación alcanzaron la biomasa máxima a los 5 días, donde el sistema con agitación obtuvo un peso húmedo de 29±8 g/L y 1.3±0.2 g/L de peso seco y para el sistema con bafles se consiguió 24±6 g/L de peso húmedo y 1.0±0.2 g/L peso seco. En cambio, la biomasa del sistema sin agitación se alcanzó a los 7 días con una biomasa de 13±7 g/L de peso húmedo y 1.1±0.4 g/L de peso seco. Por otra parte, se comparó el crecimiento de L. chapmanii en dos tipos de biorreactores: uno agitado y uno de burbujeo, utilizando los medios de cultivo PYG y SG. En el biorreactor agitado, se observó que el hongo solo crecía en las paredes del reactor cuando se utilizaba el medio PYG, resultando en una biomasa pobre en 10 días. En contraste, al utilizar el medio SG en el mismo biorreactor, se obtuvo una biomasa de 49 g/L de peso húmedo y 2.8 g/L de peso seco en 6 días. Este medio promovió un crecimiento mayoritario en el seno del líquido, aunque también se observó adherencia en las paletas y baffles del reactor. Cuando se utilizó el biorreactor de columna de burbujeo con el medio PYG, no se observó crecimiento del hongo hasta los 10 días de cultivo. En cambio, al emplear el medio SG en el mismo tipo de biorreactor, se obtuvo una biomasa de 50 g/L de peso húmedo y 3 g/L de peso seco en solo 24 horas. El biorreactor con el medio SG demostró un rendimiento superior en comparación con el tanque agitado, ya que produjo una biomasa comparable en un tiempo significativamente más corto. Establecido el tipo de biorreactor y el medio de cultivo, lo siguiente fue analizar un tipo de formulado adecuado que permita almacenar las zoosporas, sin ser perjudicial a las larvas. Para ello se evaluó la toxicidad de dos formulados: el primero consistió en una mezcla de PVP, Glicerol y Goma Xántica (mezcla GX) y el segundo consistió en la encapsulación con alginato de sodio. Cuando se realizó la mezcla GX, se observó que las larvas de mosquito murieron en un tiempo menor al de L. chapmanii, es decir, que de alguna manera este formulado resultó tóxico. A continuación, se evaluó la toxicidad del alginato de calcio con las larvas de mosquitos, este resultado dio el esperable, el cual no resultó tóxico; por lo tanto, se decidió evaluar diferentes concentraciones de alginato y calcio, para disminuir costos en producción de las perlas. Se evaluaron las siguientes concentraciones: alginato al 3% con 1% de CaCl2, alginato al 2% con 2% de CaCl2, alginato al 2% con 1% de CaCl2, alginato al 2% con 0.5% de CaCl2, alginato al 2% con 0.25% de CaCl2, alginato al 1.5 con 0.5 % de CaCl2, alginato al 1.5% con 0.25% de CaCl2, alginato al 1% con 1% de CaCl2 y alginato al 1% con 0.5% de CaCl2. De todas las concentraciones ensayadas la que permitió una buena formación de perlas fue la de 2% de alginato y 0.5% de calcio, por lo que los siguientes ensayos se realizaron con dicha relación. Por último, se evaluó la mortalidad de las larvas de mosquitos para los tres medios de cultivo en las diferentes condiciones de agitación, para los biorreactores y para el formulado de alginato de calcio, ya que este tipo de ensayos pueden afectar a la virulencia de las larvas de mosquitos. Cuando se evaluó la mortalidad en los tres medios de cultivo en las tres condiciones de agitación diferente, se encontró que en el caso del medio PYG el sistema sin agitación presentó una mortalidad del 83.8% en 8 horas, para el medio SG ambos sistemas con agitación tuvieron una mortalidad de 86.5% en 24 horas, y para el medio HS el mejor sistema fue con baffles logrando una mortalidad del 89.6% a las 24 horas. Al compararse estos tres sistemas se concluyó que, si bien en el medio PYG se observó una mortalidad alta a un menor tiempo, los otros sistemas no tardaron mucho más tiempo en obtener un porcentaje elevado de muerte. Considerando otros factores como la biomasa máxima y su tiempo de obtención (mostradas en el Capítulo I), el mejor sistema es con agitación y baffles utilizando el medio de SG. La mortalidad evaluada en los biorreactores fue utilizando el tanque agitado y columna de burbujeo con el medio SG. Se halló que el tanque columna de burbujeo presentó una mortalidad del 100% mientras que el tanque agitado fue cerca del 33%. Con respecto a la formulación, se evaluó la mortalidad de las larvas de mosquitos a diferentes tempos (0, 10, 20 y 30 días) con la encapsulación. En ningún caso se evidenció mortalidad, llegando a la conclusión que algún factor durante el proceso de encapsulado perjudicó a las zoosporas. Una justificación de estos resultados, pudo deberse a que la agitación durante el procedimiento de encapsulación y/o la presencia de Ca hayan modificado la virulencia de las zoosporas. Además, la encapsulación impide el contacto entre las zoosporas y las larvas evitando la infección por contacto, y a su vez, las larvas no pudieron ingerir a las zoosporas evitando la infección por ingestión. En conclusión, los resultados de este estudio resaltan el potencial de L. chapmanii como una herramienta eficaz en el control biológico de mosquitos, ofreciendo una alternativa prometedora a los métodos químicos tradicionales. Los hallazgos proporcionan una base sólida para futuros estudios y aplicaciones prácticas, con el objetivo de desarrollar estrategias de manejo integrado de plagas más sostenibles y eficientes.