Desarrollo de una plataforma de baculovirus recombinantes destinados a la expresión de múltiples genes terapéuticos en células de mamífero

Abstract

El baculovirus AcMNPV (Autographa californica Multiple Nucleopolyhedrovirus) ha sido ampliamente utilizado para la producción de bioinsumos. En ese sentido, el mejoramiento de las tecnologías usadas para la producción de AcMNPV recombinantes (recAcMNPV) resulta de particular interés. El objetivo de este trabajo consistió en el desarrollo de un nuevo sistema llamado PluriBAC, basado en la tecnología de clonado por Golden Gate utilizando enzimas de restricción (ER) tipo IIS para el ensamblado simultáneo de múltiples fragmentos en un mismo vector. PluriBAC consta de tres niveles que permiten la combinación de módulos. Los vectores del nivel 1 poseen las secuencias compatibles con los módulos provenientes del nivel 0. Asimismo, a partir del nivel 1, se obtendrá el plásmido del nivel 2 con el ensamblado final de los múltiples bloques. Mientras que los vectores del nivel 2 contienen secuencias que permiten la recombinación homóloga con el bácmido bApGOZA, plásmidos del nivel 1 se adaptaron para permitir la generación de recAcMNPV a través de trasposición en bacterias (Bac-to-Bac). En este trabajo presentamos un sistema versátil, basado en Golden Gate, para la generación de baculovirus recombinantes. Presentamos diferentes baculovirus reporteros generados con este sistema que nos permitieron evidenciar que conservaron tanto la capacidad infectiva como transductora en modelos in vitro e in vivo. Como campo de aplicación de este nuevo sistema, elegimos la terapia antitumoral aplicada, en particular, al Glioblastoma Multiforme (GBM). El GBM representa el 49% de los tumores cerebrales malignos y se caracteriza por su invasividad y resistencia intrínseca a la terapia convencional, por lo que el tumor recurre y es letal de 6 a 15 meses luego del diagnóstico. A pesar de los esfuerzos para mejorar el tratamiento de este tumor, la sobrevida de los pacientes con GBM no ha mejorado en los últimos 20 años. Por este motivo, con el fin último de incrementar el abanico de alternativas terapéuticas contra esta enfermedad, nos propusimos caracterizar nuevos posibles blancos moleculares mediante, en primer lugar, análisis in silico a partir de bases de datos de biopsias de pacientes y, en segundo lugar, a través de validaciones experimentales en modelos de GBM in vitro. Uno de los blancos terapéuticos que estudiamos fue la proteína serina/treonina quinasa asociada a receptor 1 (RIPK1), considerada como un regulador maestro de la decisión celular entre la señalización pro-supervivencia y la muerte celular. A partir de nuestros estudios in silico pudimos concluir que los niveles de expresión de RIPK1 se encuentran fuertemente asociados a los gliomas más agresivos y con un peor pronóstico, y al sostenimiento de la inflamación crónica característica del GBM mediante la regulación positiva de vías de muerte celular inflamatorias como la piroptosis y la necroptosis. Esto a su vez podría conducir a una mayor infiltración inmunológica en el microambiente tumoral. Para validar experimentalmente este blanco molecular utilizamos dos estrategias diferentes. Por un lado, utilizamos un inhibidor comercial de la actividad quinasa de RIPK1 y observamos un efecto positivo sobre la sensibilización de las células de GBM ante el tratamiento combinado con el quimioterápico cisplatino, disminuyendo significativamente la proliferación celular e inhibiendo la apoptosis. En segundo lugar, diseñamos y generamos un baculovirus recombinante, utilizando el sistema PluriBAC, capaz de silenciar la expresión de RIPK1, observando un efecto aún más marcado sobre la proliferación y la muerte celular programada. El segundo blanco terapéutico abordado fue el receptor de la prolactina (PRLR). La prolactina es una hormona que se encuentra relacionada con la supervivencia y la proliferación celular en diferentes tipos de tumores respondedores a hormonas y también en los GBM. Nuestros análisis in silico revelaron que la expresión de PRLR se correlaciona con aquellos tumores más agresivos y con algunos de los genes involucrados en las vías proliferativas. Análogamente, para las validaciones in vitro, generamos un baculovirus recombinante que codifica para un antagonista de la prolactina, capaz de inhibir la vía de señalización de PRLR. Al tratar las células de GBM con este baculovirus observamos una significativa disminución de la viabilidad celular. La sumatoria de los resultados obtenidos sugieren que los recAvMNPV generados mediante el sistema PluriBAC, destinados a regular negativamente a RIPK1 y a PRLR, podrían ser candidatos promisorios para el tratamiento contra el Glioblastoma Multiforme.