Función de Me31b y eIF4E en la regulación de la traducción

Abstract

La regulación de la expresión génica involucra diversos mecanismos, parte de la regulación postranscripcional involucra focos citoplasmáticos formados por agregados ribonucleoproteicos (mRNPs). Entre los componentes conservados encontramos a una helicasa de ARN, Me31B en Drosophila melanogaster (Dm) y al factor de traducción eIF4E (4E). Me31B participa en las vías de degradación del ARNm mientras que 4E es un factor de inicio de la traducción que además participa en la represión de la misma cuando interactúa con Me31B. A. morenensis (Amo) es un plecóptero estenotérmico que habita los glaciares patagónicos y no sobrevive la congelación ni temperaturas mayores que 15°C, por lo que es un fascinante sistema de estudio de los mecanismos moleculares de regulación de la traducción en frío. Resultados previos del grupo demostraron que el ortólogo de Me31B (Amo-Me31B) está altamente conservado, mientras que el análisis del único ortólogo de 4E encontrado en el transcriptoma (Amo-eIF4E) mostró varias sustituciones de aminoácidos que, junto al modelado in silico, muestran su semejanza al ortólogo no canónico eIF4E8 de Dm. Así mismo, demostramos que Me31B interactúa con 4E1 y 4E3 a través de sitios específicos para cada isoforma. Por ello, proponemos evaluar en profundidad los dominios de interacción entre Me31B y 4E y extender nuestros análisis a los ortólogos de Amo evaluando posibles cambios evolutivos relacionados con la temperatura.Para evaluar las interacciones se clonaron los fragmentos de Me31B salvaje y mutante, correspondientes al sitio de interacción con las isoformas de 4E y los ortólogos en Amo. Las interacciones se evaluarán in vitro mediante pull-down e in vivo en levadura y células S2R+. Las secuencias de las proteínas clonadas en pET-SUMO se transformaron en bacterias E. coli BL21(DE3) para expresar las proteínas recombinantes, se purificaron con columna de Ni+2 en ÄKTA start y con nanopartículas magnéticas.Mediante ensayos de doble híbrido se espera determinar los aminoácidos específicos que participan en la interacción entre Me31B y 4E y a su vez si la interacción se mantiene en Amo. Actualmente se mandaron a secuenciar los clonados en pOBD2 y pGAD424 y se está poniendo a punto la concentración necesaria de 3-AT que inhibe la expresión basal de His.Se expresarán las proteínas de fusión fluorescentes mediante la transfección de las células con los clones en pDsRed1-N1 y pEGFP-N1, se evaluará la localización celular de las proteínas. A su vez, se analizará si los mutantes de Me31B que no interactúan con 4E modifican su localización en mRNPs y si colocalizan con 4E1 y 4E3. La localización de las proteínas de Amo se evaluará entre 25 y 14ºC, temperaturas a las cuales las S2R+ están adaptadas y que permitirán acercarse a las condiciones de vida del insecto. Esperamos poder contribuir en explicar los mecanismos de regulación de la traducción de ARNm donde isoformas de eIF4E forman mRNPs diferentes usando distintos dominios de interacción.