Identificación y validación de genes que codifican para factores de transcripción (TFs) que poseen cambios en la expresión de sus isoformas o cambios en su splicing alternativo (AS) debido a la activación de la respuesta de defensa de tomate ante Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst)

Abstract

Identificación y validación de genes que codifican para factores de transcripción (TFs) que poseen cambios en la expresión de sus isoformas o cambios en su splicing alternativo (AS) debido a la activación de la respuesta de defensa de tomate ante Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst).Las plantas están expuestas a una amplia variedad de patógenos y, para defenderse poseen un sistema de defensa que se puede clasificar en dos estratos. El primero se denomina PTI (pattern-triggered immunity) y se activa mediante el reconocimiento de MAMPs (microbe-associated molecular patterns). Patógenos como Pst pueden inyectar proteínas efectoras en el citoplasma de las células vegetales y promover la susceptibilidad. Algunas plantas evolucionaron un segundo estrato de defensa llamado ETI (effector-triggered immunity) que requiere proteínas de resistencia (R) capaces de reconocer estos efectores y activar la respuesta hipersensible (HR). Las plantas de tomate Río Grande PtoR detectan dos efectores de Pst (AvrPto y AvrPtoB) mediante las proteínas Pto/Prf.El AS es un mecanismo de regulación post transcripcional que produce múltiples variantes de transcriptos y por lo tanto de proteínas a partir de un mismo gen. En las plantas, la mayoría de los genes que contienen intrones están sometidos a AS. Estudios recientes revelaron que un gran número de genes de defensa son sometidos a este proceso y que el mismo es modificado ante la infección por patógenos. Recientemente se describió un transcriptoma de tomate detallado, mediante la combinación de diferentes técnicas de secuenciación. Dicha anotación, que incorpora isoformas de genes codificantes, representa una herramienta para la identificación de eventos de AS como consecuencia de la activación de la respuesta inmune de tomate. A partir de datos de RNA-Seq de tomate ante distintos desafíos se filtraron las lecturas para remover la contaminación de ARN ribosomal con Bowtie y se alinearon al genoma de tomate empleando HISAT2. Luego se cuantificaron los transcriptos y se normalizaron a FPKM (fragments per kilobase of transcript per million mapped reads) con StringTie utilizando la anotación generada en Zeng y col. (2022). Se realizó un análisis para detectar transcriptos diferencialmente expresados (TDEs) entre el tratamiento control y el desafío, con DESeq2. A partir del listado de TDEs se identificaron aquellos que codifican para TFs, proteínas quinasas (PKs) y reguladores de la transcripción (TRs) de tomate descriptos en la base de datos del ITAK. Mediante la herramienta GffCompare se identificaron aquellos pertenecientes a las categorías de clasificación de interés (j, k, m y n) que poseen AS. Combinando estos análisis, se identificaron aquellos que cambian transcripcionalmente al activarse la inmunidad de tomate, a partir de estos resultados se analizaran las secuencias de las isoformas de interés en busca de dominios esenciales para la función del TF, y si el AS afecta dichos dominios.