Aislamiento, purificación y caracterización de las endopeptidasas cisteínicas presentes en frutos de Pseudananas macrodontes (Morr.) Harms (Bromeliaceae)

Abstract

Si bien las enzimas proteolíticas se hallan presentes en todas las células, en los organismos multicelulares de mayor complejidad suelen no tener una distribución uniforme y con frecuencia algunos tejidos y órganos las contienen en elevada concentración. Dadas las múltiples aplicaciones industriales de este tipo de enzimas, la detección de nuevas fuentes de proteasas a partir de recursos naturales renovables sigue siendo un tema de gran atractivo dentro del campo de la Química de Productos Naturales. En esta línea de razonamiento, la selección de nuevos materiales dentro de las plantas superiores tuvo que basarse necesariamente tanto en la información fitoquímica preexistente como en los aportes que la Fisiología y la Bioquímica Vegetales han realizado en cuanto a las funciones biológicas que desempeñan o se les atribuyen a las peptidasas en las células que las contienen y en los organismos de los que forman parte. Aún cuando el número de especies estudiadas con el propósito antes mencionado sigue siendo muy reducido (bastante menos del 1% de las especies conocidas), los datos de los que se dispone brindan una razonable orientación en cuanto a materiales vegetales que pueden resultar fuente promisoria de nuevas peptidasas. Si bien no en todos los casos, el contenido de los tubos laticíferos suele ser rico en este tipo de sustancias, a tal punto que la mayoría de las fitopeptidasas conocidas provienen de especies pertenecientes a familias caracterizadas por producir látex: Asclepiadaceae, Apocynaceae, Caricaceae, Euphorbiaceae y Moraceae, entre otras. Por otra parte, así como la presencia de látex no garantiza la existencia de enzimas proteolíticas, su ausencia tampoco descarta la posibilidad de hallarlas en especies pertenecientes a familias “no laticíferas”, como lo demuestra su hallazgo en Asteraceae, Bromeliaceae, Cucurbitaceae y Fabaceae, por citar los casos más conocidos. Parece más allá de toda duda que el desarrollo de la capacidad de producción de peptidasas en alta concentración tiene claras implicancias evolutivas. En el caso de la familia Bromeliaceae dicha capacidad parece estar restringida a sólo una de las tres subfamilias que la componen: las Bromelioideae, hecho en el que basamos nuestra hipótesis de trabajo al seleccionar los frutos de Pseudananas macrodontes (Morr.) Harms (n.v. “ihvirá”, “falso ananá”) como material de estudio de nuevas fuentes de fitopeptidasas. Una vez seleccionado el material y comprobada que fue la presencia de enzimas proteolíticas, resultó necesario establecer el procedimiento de extracción que permitiera obtener la mayor cantidad de proteína activa y al mismo tiempo preservar la integridad funcional de la misma, de modo de disponer de suficiente material de estudio y, además, que el mismo fuera representativo del estado en el que se encontraban las peptidasas en su localización original en la planta. Dado que las enzimas proteolíticas son utilizadas en distintos procesos industriales y teniendo en cuenta que en estos casos se recurre a preparaciones prácticamente no purificadas, también se consideró esencial contar con información sobre el comportamiento de estas últimas. En función de ello se decidió verificar el efecto del pH y de la fuerza iónica sobre la actividad proteolítica, así como la estabilidad de la enzima parcialmente purificada en distintas condiciones de pH y de temperatura. El paso siguiente consistió en diseñar una estrategia de purificación que permitiera separar las principales proteínas responsables de la actividad proteolítica de la muestra, necesaria para la posterior caracterización bioquímica y estructural de las mismas. En la elección de la metodología de purificación se procuró en lo posible que la misma resultara factible de ser escalada, teniendo en cuenta que las enzimas purificadas tienen alto valor agregado. La etapa final en el conocimiento de este tipo de biomoléculas es su caracterización, que además de las condiciones óptimas de acción implican el conocimiento de su masa molecular y del punto isoeléctrico, de sus características cinéticas y de su secuencia aminoacídica, estableciendo en este último caso la pertinente comparación con las estructuras de otras proteasas, a efectos de determinar el grado de homología que presenta en relación con las mismas, tanto por las implicancias filogenéticas como por el aporte que puede ofrecer al esclarecimiento de la especificidad de sustrato.