Caracterización funcional de la vía del microRNA390/TAS3 en el desarrollo de órganos laterales en las raíces de la leguminosa Medicago truncatula

Abstract

Las plantas adaptan su arquitectura de raíz como parte de la respuesta a los cambios en las condiciones ambientales, tales como disponibilidad de agua, nutrientes y estreses de tipo biótico y abiótico. En particular, las plantas leguminosas desarrollan dos tipos de órganos laterales post-embrionarios en sus raíces, las raíces laterales (RLs) y los nódulos fijadores de nitrógeno. Las RLs participan en el anclaje de la planta al suelo y en la incorporación de agua y nutrientes. Los nódulos, los cuales se desarrollan a partir de la interacción simbiótica entre las leguminosas y las bacterias del suelo conocidas como rizobios, proveen compuestos nitrogenados asimilables a la planta. Ambos órganos poseen un fuerte impacto en el crecimiento de la planta, por lo tanto la comprensión de los mecanismos moleculares involucrados en el desarrollo de las RLs y los nódulos contribuiría a mejorar y aumentar el rendimiento de cultivos de importancia agronómica, así como también a recuperar tierras pobres en nitrógeno y reducir el impacto negativo de los fertilizantes químicos sobre la biodiversidad. Los microRNAs (miRNAs) son pequeños RNAs de 21-22 nucleótidos que actúan como reguladores post-transcripcionales de la expresión génica en organismos eucariotas durante el desarrollo de nuevos órganos o en respuesta a estímulos ambientales. En los últimos años, se han descripto miRNAs cuyos niveles se acumulan diferencialmente en diferentes etapas del desarrollo de las RLs o nódulos, sin embargo sólo un número reducido de ellos han sido caracterizados en detalle y asociados con una función en la infección rizobiana y/o la organogénesis y desarrollo del nódulo. En el presente trabajo de tesis doctoral se propuso como objetivo general caracterizar la vía de miR390/TAS3 durante el desarrollo de los órganos laterales en las raíces de la leguminosa modelo M. truncatula. El miR390 se asocia a la proteína ARGONAUTA7 y posee como target al transcripto no codificante TAS3, a partir del cual se generan los trans-acting interference small RNA (tasiRNAs). Estos tasiRNAs regulan mediante un mecanismo de clivaje los niveles de los transcriptos que codifican los Factores de Transcripción Regulados por Auxinas (ARF)2, ARF3 y ARF4, por lo que han sido denominados tasiARFs. Estudios previos en nuestro laboratorio, sugirieron que la vía miR390/TAS3 estaría involucrada en la infección rizobiana y/o en la organogénesis del nódulo. Con el fin de evaluar la acumulación y la expresión espacio-temporal de los transcriptos y los pequeños RNAs que componen esta vía en diferentes estadios de desarrollo de los órganos laterales de la raíz, se llevaron a cabo reacciones de RT-qPCR y fusiones transcripcionales de los promotores a los genes reporteros gfp y uidA (también conocido como gen gus dado que codifica la proteína β-glucuronidasa (GUS)). Estos resultados mostraron que la vía miR390/TAS3 se reprime en etapas tempranas de la interacción entre M. truncatula y S. meliloti, liberando la represión post-transcripcional de ARF2, ARF3 y ARF4. A su vez, hemos identificado y validado una nueva variante del transcripto TAS3 que probablemente actúa como un target mimicry endógeno de miR390 y contribuiría a disminuir los niveles de miR390 en esta etapa. En estadios más avanzados de la interacción, la vía es re-activada quedando restringida a la zona apical del nódulo. Para indagar sobre la función de la vía se generaron raíces transgénicas que sobreexpresaban el precursor de miR390b (OX390) o un target mimicry de miR390 (MIM390) capaz de secuestrar al miR390 y bloquear su acción. Además de la estrategia de expresión target mimicry, se utilizaron líneas mutantes en el gen AGO7, en las cuales la vía miR390/TAS3 se encuentra inactiva. La evaluación del fenotipo asociado a la arquitectura de raíz y a la nodulación en las plantas OX390, MIM390 y ago7 reveló que la vía miR390/TAS3 actúa como un regulador positivo sobre la elongación de las RLs, posiblemente como consecuencia del incremento de la señalización y/o respuesta a auxinas, y como un módulo represor de la infección rizobiana y el desarrollo de nódulos. A su vez, la inactivación de la vía miR390/TAS3, ya sea en las raíces MIM390 o ago7, resultó en el desarrollo de nódulos que presentan una distribución espacial y morfología alterada. El análisis de la acumulación de transcriptos, previamente descriptos como marcadores de la nodulación, en las raíces OX390, MIM390 y ago7 permitió establecer una correlación entre los niveles de ARF2, ARF3 y ARF4 y dos factores de transcripción de la familia GRAS designados NSP (Nodulation Signaling Pathway)1 y NSP2, sugiriendo que ambos factores de transcripción serían los candidatos por medio de los cuales la vía de miR390/TAS3 y la vía de señalización de la nodulación se intersectan. Con el objetivo de identificar genes cuyos niveles de acumulación se encuentran afectados directa o indirectamente por la sobreexpresión de miR390, se caracterizó el transcriptoma de las raíces OX390 en presencia y ausencia del rizobio mediante RNA-seq. El análisis in silico de los datos generados permitió identificar genes con expresión diferencial regulados negativamente o positivamente en respuesta a la sobreexpresión de miR390. Entre estos, se destacan genes marcadores de nodulación, factores de transcripción miembros de la familia LOB, genes involucrados en la respuesta y señalización de hormonas y genes relacionados con la traducción. Los resultados obtenidos en el presente trabajo de tesis doctoral han permitido avanzar en el conocimiento sobre la regulación post-transcripcional de genes durante dos procesos de desarrollo con relevancia ecológica y agronómica. Este conocimiento podría ser aplicado en etapas futuras a la optimización de incorporación de nutrientes y nitrógeno en las plantas, contribuyendo a mejorar y aumentar el rendimiento de los cultivos de leguminosas.