Metabolismo de nitrógeno en Bradyrhizobium diazoefficiens: caracterización funcional de las proteínas PII y glutamino sintetasas

Abstract

La escasez de nutrientes es probablemente la condición de crecimiento más parecida al hábitat natural de los rizobios en el suelo. Por lo tanto, estos microorganismos deben estar habituados a sobrevivir en entornos con condiciones fluctuantes de “hambre y abundancia” y a los diferentes estreses ambientales que soportan. Durante estas modificaciones, las bacterias regulan sus actividades metabólicas para dar lugar a un fenotipo de adaptación al entorno desfavorable. En este sentido, se sabe que las condiciones óptimas de infección de las raíces de soja y formación de los nódulos que permiten la FBN se observan cuando la relación C/N es alta en la rizósfera. Nuestro grupo de investigación ha observado que los rizobios cultivados bajo escasez de la fuente de N son más persistentes, infectivos y competitivos. Estos resultados nos llevaron a pensar que esta condición de cultivo podría utilizarse con ventaja en la elaboración de inoculantes más efectivos para soja. El estado de limitación de N probablemente se asemeje más a las condiciones en las que se encuentran los rizobios en el suelo, a diferencia de las bacterias del inoculante que se elaboran cultivando los rizobios en medios ricos. Con todas estas premisas, podría plantearse la alternativa de preparar inoculantes en medios de alta relación C/N, para lo cual es necesario conocer cómo ésta relación C/N modifica el metabolismo general de los rizobios para luego encarar un diseño racional de inoculantes con alta eficiencia simbiótica. Por lo tanto, nuestra hipótesis de trabajo consiste en que es posible mantener estas buenas propiedades simbióticas, alcanzadas en la situación de escasez de N, estudiando cómo los reguladores más importantes involucrados en el metabolismo de N en B. diazoefficiens se expresan y controlan otros genes para adaptarse a esta situación particular, tanto en vida libre como en simbiosis. Para ello, es necesario conocer cómo funcionan los mecanismos de regulación del N en este rizobio (NSR) y su influencia en la FBN. Es interesante señalar que al momento en que se inició este trabajo de Tesis Doctoral contábamos con muy poca información sobre las principales proteínas involucradas en la cascada de respuesta al estrés por N y en la asimilación de NH4+ en B. diazoefficiens. Las últimas publicaciones se remontaban a los años 1987/1988 y se basaban en el estudio de la expresión de los genes glnA y glnII, que codifican las glutamino sintetasas, cuyas secuencias se habían encontrado por homología con otros microorganismos previamente descriptos como E. coli (Carlson et al., 1987; Martin et al., 1988). En cuanto a las proteínas de señalización PII, Martin y col. (1989) pudieron describir la presencia del gen glnB y la regulación de la expresión del mismo a partir de dos promotores en tándem. Sin embargo, la caracterización funcional de GlnB continuaba siendo una incógnita ya que la deleción de dicho gen no fue posible con las técnicas de la época. Incluso, nada se conocía de la presencia del gen glnK en B. diazoefficiens hasta la secuenciación de su genoma (Kaneko et al., 2002). Dada la relevancia de aumentar el rendimiento del cultivo de soja en forma sustentable, en este trabajo de Tesis Doctoral se plantea profundizar el conocimiento sobre cómo los sistemas regulatorios se activan para adaptarse a la escasez de N en B. diazoefficiens tanto en vida libre como en simbiosis, así como también proponemos profundizar en la regulación global del metabolismo de N en estas bacterias ya que parece ser un factor clave para una simbiosis exitosa. Objetivos de este trabajo de Tesis Doctoral Objetivo General: En este trabajo de Tesis nos planteamos como objetivo principal caracterizar la cascada regulatoria del metabolismo de N en B. diazoefficiens, tanto en vida libre como en simbiosis con plantas de soja, y comprender y estudiar en qué condiciones metabólicas se activa la respuesta al estrés por N en este rizobio. Asimismo, es nuestro objetivo a fututo establecer, con los conocimientos ganados, condiciones de cultivo favorables para el desarrollo de formulaciones de inoculantes para soja con mayor eficiencia simbiótica. Objetivos específicos: 1- Evaluar la fisiología del crecimiento de B. diazoefficiens en medios definidos desarrollados para generar condiciones de exceso o limitación de N. 2- Obtener, mediante mutagénesis dirigida, cepas mutantes en las proteínas de señalización PII: GlnB, GlnK1 y GlnK2, involucradas en la regulación del metabolismo del N en B. diazoefficiens, y estudiar el entorno génico de cada una de ellas, así como también las características de sus secuencias proteicas mediante análisis in sílico. 3- Analizar la posible función de las diversas copias de la enzima glutamino sintetasa GS, realizando un análisis comparativo de sus secuencias a partir de herramientas bioinformáticas, así como también obteniendo cepas mutantes en los genes glnA1, glnA2, glnA3 y glnII. 4- Caracterizar fenotípicamente los distintos mutantes obtenidos en B. diazoefficiens con el fin de evaluar el posible rol de cada una de las proteínas mutadas en la regulación del metabolismo de N en este rizobio en vida libre. 5- Evaluar los mutantes obtenidos en relación a su interacción simbiótica con las plantas de soja.