Regulación transcripcional y mecanismos de acción de dos factores de transcripción (FT) del tipo WRKY implicados en la defensa de tomate contra Pseudomonas syringae pv

Abstract

Para detectar y defenderse de los organismos patógenos, las plantas utilizan un sistema que consta de dos fases: PTI (pattern-triggered immunity) cuya activación se da luego de la percepción de MAMPs (microbe-associated molecular patterns) y ETI (effector-triggered immunity). Pst inyecta efectores en células vegetales para contrarrestar sus respuestas y generar cambios metabólicos que favorecen su proliferación en el tejido vegetal. Las plantas resistentes a estos patógenos codifican para proteínas de resistencia que median el reconocimiento de ciertos efectores conduciendo a la activación de la ETI.La activación de la PTI y la ETI llevan a cambios transcripcionales, de los que participan los FT. El análisis de genes candidatos derivados de datos RNA-seq realizados previamente permitió identificar dos FT del tipo WRKY (SlWRKY22 y SlWRKY25), cuya caracterización en N. benthamiana determinó que estos FT son reguladores positivos de la inmunidad contra patógenos bacterianos y no bacterianos. Luego, estudios realizados utilizando tomates mutantes demostraron que modulan el cierre estomático y regulan la defensa contra Pst.Nuestro objetivo general de trabajo es estudiar la participación de estos FT WRKY en la defensa de tomate y evaluar de qué manera participan en la activación de las respuestas inmunes en esta planta. Objetivos específicos:1. Evaluar el metabolismo de hormonas en plantas de tomate doble mutante (Δwrky22/25): se usarán plantas Δwrky22/25 y plantas salvajes Río Grande-PtoR (PtoR). Previamente se vio que estas plantas mutantes, en comparación a PtoR, tenían mayor conductancia estomática, estomas más abiertos en estado basal y que no respondían a estímulos como la oscuridad y el patógeno. Esto sugiere alteraciones en el metabolismo de las principales hormonas que regulan la apertura y el cierre estomático, tales como ácido abscísico, etileno, citocininas, metil jasmonato, ácido salicílico y/o estringolactonas. Para analizar esto, realizaremos diversos tratamientos con hormonas y mediremos sus niveles endógenos. 2. Analizar la posible participación de los WRKYs en la resistencia sistémica adquirida (SAR): se quiere evaluar el estado funcional de la SAR en las plantas mutantes ya que que los análisis previos fueron realizados sólo de manera local. Para esto se infiltrarán plantas PtoR y Δwrky22/25 con diferentes cepas de Pst DC3000 y se determinará su crecimiento bacteriano en el tejido sistémico. 3. Identificar posibles genes blanco de estos FT: para realizar un análisis de los cambios transcripcionales que ocurren debido a la regulación de estos FT, se llevarán a cabo ensayos de RNA-seq comparando plantas PtoR y Δwrky22/25 frente a distintas cepas de Pst. Los datos obtenidos se analizarán en busca de genes diferencialmente expresados. 4. Generar plantas sobreexpresantes de SlWRKY25: generaremos plantas sobreexpresantes estables del WRKY25 de las cuales obtendremos líneas homocigotas para determinar su respuesta frente al patógeno.