Búsqueda de marcadores predictivos de diabetes y prediabetes a través de la identificación de genes diferencialmente metilados en islotes y leucocitos de ratas sometidas a una dieta rica en fructosa

Abstract

La prediabetes (PD) antecede a la diabetes tipo 2 (DT2) y su prevención y/o tratamiento a tiempo puede prevenir o enlentecer su progresión a DT2. Nuestro objetivo es identificar en islotes y leucocitos de ratas con alteraciones semejantes a las de la PD humana (ratas alimentadas con una dieta rica en fructosa [DRF]) aquellos genes que modifiquen consistentemente su patrón de metilación de ADN en islas CpG. De nuestro trabajo surgirán los genes que, si sufriesen los mismos cambios epigenéticos en leucocitos humanos, podrían erigirse en “Marcadores epigenéticos de PD” (MEPD) y ser detectados por un método simple y relativamente económico (PCR) para un diagnóstico precoz de PD. Esto será de gran importancia en “salud pública” ya que permitirá la implementación de estrategias costo-efectivas para la prevención y/o retraso de su progresión a DT2. Utilizamos ratas Sprague Dawley macho alimentadas ad libitum con dieta estándar, divididas en 7 grupos según la bebida ofrecida, los grupos C21 y C70 recibirán agua por 21 ó 70 días respectivamente, los grupos F21 y F70 beberán una solución de fructosa al 10% p/v (F10%) por 21 ó 70 días y el grupo F21C49 consumirá F10% los primeros 21 días y completará los 70 días de tratamiento bebiendo agua. Los últimos dos grupos recibirán las mismas dietas que los grupos F70 y F21C49 con el agregado de un tratamiento antioxidante (ácido α lipoico) los últimos días de tratamiento (grupos F70L y F21C49L). Luego del sacrificio, obtendremos muestra de sangre para extraer ADN y hacer las siguientes determinaciones séricas: glucemia e insulinemia (cálculo del Índice de resistencia a la insulina y función β), perfil lipídico (triglicéridos y colesterol) y ácidos grasos libres y peroxidación lipídica (TBARS). Se realizarán estudios histológicos y morfométricos del páncreas y se aislarán islotes con colagenasa para el aislamiento del ADN, el estudio de la secreción de insulina estimulada por glucosa y la expresión génica (RT-qPCR y Western Blot). Los genes y proteínas que se analizarán serán en su mayoría, genes involucrados en la regulación de la función y masa celular β, apoptosis, angiogénesis, vía de señalización de insulina y leptina y estrés oxidativo de origen mitocondrial. La secuenciación masiva de ADN genómico con bisulfito permitirá el estudio del metiloma y la identificación de MEPD. Se intentará evaluar la posible reversión del aumento de los MEPD luego de haber revertido el cuadro de PD por un cambio en el hábito alimenticio y/o la incorporación del agente antioxidante. A su vez, el grado de metilación de los genes que resulten diferencialmente metilados en los animales con PD serán evaluados en sus leucocitos por un método relativamente sencillo (PCR) con el fin de poder trasladar este conocimiento a los humanos y poder desarrollar un kit de diagnóstico precoz de PD de relativo bajo costo y que permita un diagnóstico rápido de esta enfermedad.